流式细胞术分析及应用

53
抗体的选择
首选直接标记抗体 荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原
FITC最便宜，适用于强表达抗原
间接标记：效果有时不太好
54
实验对照的设计
空白对照：
阴性对照：常用同型抗体对照
单色分析：设同型抗体对照
多色分析：同型对照，单阳性对照（单标） 同型对照(Isotype)：使用与抗体相同种属来源、相同亚型、 相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于 检测由于抗体非特异性结合而产生的背景染色。 阳性对照：检测阴性时
8
流式细胞仪的光学系统
激光 (Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一
方向、同步的稳定光照。 激光波长: 台式机为固定波长488nm, 635nm ，大型机波 长谱线宽包括 325， 457.9，488, 514.5，520.8，530.9， 568.3， 633，647 nm
光收集系统是由若干组透镜，滤波片，小孔组成，将产
流式细胞术分析及应用
1
主 要 内 容
流式细胞术的原理 流式细胞术的应用 流式细胞术的数据处理 流式细胞术的样品制备
2
一、流式细胞术的原理
流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物理，光电测量，计算 机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。 流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动 的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000 个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。
36
37
细胞分选
38
三、流式细胞数的数据处理
39
40
41
42
43
44
compensation
45
分析软件
常用软件 FlowJo
47
Gating
48
49
50
51
52
四、流式细胞术的样品制备
单细胞悬液，避免任何细胞沉积 被检细胞或颗粒大小0.2－40um 样品中至少20000个细胞，浓度105-106个/毫升
24
4.细胞凋亡的检测
25
Annexin V Assay
28
Annexin V/PI双染
活细胞为（Annexin V-/PI-）
坏死细胞为（Annexin V+/PI+）
凋亡细胞（Annexin V+/PI-）
29
Annexin V Assay----能够区分死亡与凋亡
30
5、细胞因子测定
Antibody coupled PE label, emitting at FL2 intensity proportional to analyte conc.
Shades of a color
33
Example 6-bead assay
IL-8 IL-1b Detector Antibodies Wash IL-10 Analyze on flow cytometer
Laminar Flow
Optical Cuvette
High Sample Flow Rate
Laminar Flow
60 mL/min
Sheat Sheath Sample h
Sheath
Sheath Sample
6
样品和鞘液流
7
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals Focused laser beam

PBS洗两遍，用200ulPBS重悬细胞，上机检测。
57
谢 谢！
58
17
Compensation
18
二、流式细胞术的应用
细胞表型分析 胞内蛋白的检测 细胞周期分析 细胞因子测定 分选 细胞内钙离子测量 ……
19
1.细胞表型分析
CD4
CD3
20
2.胞内蛋白的检测
21
22
3. 细胞周期的检测
23
CFSE（羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂）
56
胞内分子检测的样品制备


收集细胞，调至1×106细胞/毫升。
4%固定液重悬细胞，常温或4℃避光放置30分钟。


PBS洗去固定液。
穿膜液重悬细胞沉淀，4℃避光孵育30分钟。
PBS洗两遍，加200ul穿膜液重悬细胞，常温避光放置10分钟。 PBS洗一遍，100ul穿膜液重悬细胞，加入适量内标抗体或独 特型对照抗体，4℃避光孵育30分钟。
11
前向角散射光 ——FSC
Laser
FALS Sensor
12
侧向角散射光——SSC
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
13
散射光
散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形 态上的差异 - 通常使用“散点图”来看散射光信号 - 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的 数据
14
IL-6
TNF
IL-12 Capture Beads Lysate or Supernatant Sample
34
CBA Standard curves
35
6、细胞分选
488 nm laser
ຫໍສະໝຸດ Baidu
FALS Sensor Fluorescence detector
Charged Plates
-
+
Single cells sorted into test tubes
Beads
Capture antibody Capture beads
+
+
Antigen (cytokines)
Fluorescence Detector antibody
31
Beads Provide a Flexible Platform
Beads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometer
生的光信号引导至检测器。
9
流式细胞仪的光信号
散射光信号 荧光信号
10
1. 散射光信号
•前向角散射光（FSC, Forward Scatter）
入射激光的同向散射光信号
细胞相对大小及其表面积。
•侧向角散射（SSC, Side Scatter）
入射激光90角的散射光信号
细胞粒度及细胞内相对复杂性。
散点图——Dot Plot
lysed whole blood
15
2. 荧光信号
荧光素吸收激光能量
荧光素将吸收能量释放，转换为
振动能和热能
释放较入射光波长更长的光量子
荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强
16
Fluorochrome specification
3
现代流式细胞仪包括
液流系统
聚焦细胞以供检测
光学系统
激发和收集光信号
电子系统
将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计 算机分析
4
液流系统
液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处
5
Sample Flow in Optical Cuvette
Low Sample Flow Rate 12 mL/min
Multiple sizes
Different intensities
Different colors with different intensities
32
Multiplexed Beads
Various analytes
Antibody coupled beads, emitting at distinct FL3 intensities
55
表面分子检测样品制备
将细胞样本制成单细胞悬液，注意悬液内不能有粘集，团 块，尽量避免多的细胞碎片。


调整细胞浓度为5104-1×105个，用PBS洗两次，用 100ulPBS重悬细胞。
加入适量Fc受体阻断剂（与抗体匹配的动物的血清或 IgG），4℃避光放置30分钟。 加入适量的特异性表面标记荧光抗体或独特型对照抗体， 4℃避光放置30分钟。 用PBS洗两遍，用200ul固定液重悬细胞，上机检测。