总蛋白提取试剂盒

2-D relhydration/sample buffer 1可以使IPG胶条（等电聚焦）再水合化，是一种高渗缓冲剂，含两性离子去污剂ASB-14，可用于二维电泳的增溶剂。

细胞在Lysis Buffer中重悬，超声破碎，离心，上清含有可溶于水的亲水蛋白.

沉淀中再加入Lysis Buffer，除去可溶性蛋白并完全破碎裂解细胞，再加入2-D relhydration/sample buffer 1溶解沉淀中蛋白。

提供的试剂：

2-D relhydration/sample buffer 1：2管冻干粉，需要加超纯水重悬；每瓶含：7M尿素，2M硫脲，1% ASB-14去污剂，40mM 的Tris base，0.001%溴酚蓝。

Lysis Buffer：5袋。每袋溶成50ml的Lysis Buffe

TBP Reducing Agent：一个安剖瓶含有0.6ml 200mM TBP 溶于1-甲基-2-吡咯（存于氮气中）。

空瓶：用于保存TBP Reducing Agent。

未提供的试剂和材料：

2ml离心管，一次性圆底试管，50ml锥形离心管（一次性），12000-16000*g 4℃离心机，超声破碎机，Benzonase(核酸内切酶)（如：Sigma catalog#E1014、#E8263），蛋白酶抑制剂（可选），载体两性电解质（用于等点聚焦形成pH梯度），高纯水，RC DC蛋白检测试剂盒。

保存条件：

未开封的室温保存，打开后的Ready-Prep 2-D relhydration/sample buffer 1悬液分装1-2ml于-80℃保藏；Ready-Prep TBP还原剂转至空瓶-20℃保存防止TBP 蒸发；未使用的Lysis Buffer分装-20℃保藏。

试剂准备：

2-D relhydration/sample buffer 1：5.6ml超纯水轻轻混匀至完全溶解，可用手掌或水溶稍加热促溶，加热温度不要超过25-30℃，防止形成氰酸盐，氰酸盐会与蛋白反应。

TBP Reducing Agent：三丁基膦（TBP）易挥发，具有令人不愉悦的味道，需在通风橱中操作，穿实验服，手套接触安剖瓶。溢出用湿毛巾擦干，保存时于-20℃，使用时要置于冰上。

Lysis Buffer：将整袋的Lysis Buffer倒入50ml的一次性管中，加50ml的超纯水溶解，将少量溶液倒入原袋中涮一次再倒回管中。如果需要，可在使用前向Lysis Buffer中加入一定量的蛋白抑制剂。

操作说明：

1.准备Lysis Buffer和2-D relhydration/sample buffer 1

需Lysis Buffer 10ml ，sample buffer 1 1ml，Lysis Buffer冰预冷10-15min。2．将2ml离心管置于冰上，加入100-200mg细胞，加入1ml Lysis Buffer；植物细胞每100-200mg加2-3ml Lysis Buffer。

注：Lysis Buffer量不足导致细胞的裂解不完全，可溶性蛋白量偏少，植物细胞加Lysis Buffer前需彻底的粉碎成粉（液氮研磨或匀浆破碎）。

3．悬浮液于冰上进行超声破碎（超3停3，20min）。（超声时间随细胞的不同而变化，要保证细胞完全破碎）

,4-8℃处理20min除去核可选步骤：加入150U的核酸酶和2µl/ml的1M MgCl

2

酸

4．4℃,16000g离心20-30min，沉淀不可溶蛋白和细胞碎片。

5．取上清至干净的离心管并置于冰上。

6．再提取沉淀，加入等体积的Lysis Buffer 至沉淀，重复步骤3。

7．小心的取上清与之前的上清合并，即为可溶性蛋白。

8．准备适量的sample buffer 1，每次提取需要0.5-1ml的sample buffer 1，每1ml sample buffer 1 加入10µl的Ready-Prep TBP还原剂和两性电解质（终浓度为

0.2%w/v）。

依据2-D分析中IPG胶条的pH范围选择合适的两性电解质，大部分条件下可用Bio-Rad’s 的Bio-Lyle3/10两性电解质（catalog#163-2094），如需要此步可加蛋白抑制剂。

9．沉淀中加入0.5-1ml的sample buffer 1混合液，振荡或超声使蛋白完全溶解。注：如果用超声，一定要防止样品过热，必须低于30℃。温度过低会使尿素和硫脲结晶，可以稍加热溶解。

10.18-20℃，16000g离心10-20min，沉淀细胞碎片。

11．取上清至干净的离心管，即为不可溶蛋白。

12．检测可溶和不可溶的蛋白量（使用RC DC法）。

13．两部分蛋白在IEF/2-D分析前需要适量的稀释。（不可溶蛋白用加过TBP还原剂和两性电解质的sample buffer 1混合液稀释，其他试剂可能会使蛋白发生沉淀）

注：对于某些应用（如basic pH range IPG strips），蛋白样品在IEF前需进行还原和烷化处理，以得到更好的分离效果，可使用Ready-Prep Reduction-Alkylation Kit（catalog#163-2090）

14.样品即可进行2-D了，未使用的蛋白需在-80℃中保藏。