常规PCR反应的优化指南

常规PCR反应的优化指南

祁智（内蒙古大学生命科学学院）

总体原则

（1）PCR反应的条件根据具体的实验而定。没有统一的参数。

（2）PCR反应是整个分子生物学技术最核心的部分。

（3）实验操作在冰上进行。要带手套。

（4）仔细阅读试剂说明书，阅读相关产品在相关公司网站上的信息。

（5）移液器使用要缓慢，避免溶液间的交叉污染。

PCR仪器

（1）在使用前30分钟开机。

（2）检查金属孔是否有杂物。

（3）四个角要放置同反应所用PCR管一样的管，以便保持平衡。

（4）实验表明，PCR仪器各个孔的温度有一定的差距，尽量用中间的孔。

（5）判断PCR各个孔温度均一性的方法：加等量的水在PCR管内，放在不同位置的反应孔内。设置PCR温度为60度，20分钟后检查PCR管内水的位置。

PCR管

（1）选用知名公司200ul 薄壁管。

（2）注意管的底部形状是否同PCR仪器的反应金属孔良好吻合。

（3）如果多于四个反应，选用联排管。

准备PCR成分

（1）实验操作在冰上进行。要带手套。

（2）按照以下顺序添加成分：

a)超纯水

b)Buffer （缓冲液）

c)dNTP

d)Primer （引物）

e)Template (模板)

f)DNA Polymerase (DNA聚合酶)

（3）加好后，用移液器缓慢上下吸打混匀。避免气泡。

（4）如果是多个反应，先把相同的成分在1.5ml 离心管内混匀。按照120%比例。

PCR成分操作和选用的注意事项

（1）水：必须是超纯水。在1.5ml离心管内保存。关于超纯水的制备，请参考本实验室相关章节。

（2）Buffer （缓冲液）

●不同公司，不同的DNA Polymerase，对应不同的Buffer。要清楚的区分。

●切记要分装，避免反复冻融。第一次从公司买来要分装。一般是1ml。先250微升

分装到四个管内。然后取一个管，分装50微升到五个管内。清楚标记。

●特别注意Buffer （缓冲液）是否有镁离子。如果没有需要额外添加。

（3）dNTP

●不同公司，不同的DNA Polymerase，对应不同的dNTP，主要是融dNTP的溶液不

同公司很有可能是不同的。要清楚的区分。

●切记要分装，避免反复冻融。第一次从公司买来要分装。一般是1ml。先250微升

分装到四个管内。然后取一个管，分装50微升到五个管内。清楚标记。

（4）Primer (引物)

●引物最核心，最重要的是特异性。学会如何利用基因组数据库去判断引物特异

性。为了特异性，其他条件都是可以变动的。其他条件都是子满足特异性的前

提下考虑的。

●一般长度为23－35 个核苷酸。但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度

大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应

●理想的GC 含量为40－60%

●计算的退火温度（Tm）应在50－65℃

●两条引物间Tm 差值应在5℃以内

●避免引物形成引物内二级结构（如发卡结构）以及引物二聚体

（软件模拟；/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/

●当引入限制性位点时，需要在识别位点5' 端额外添加4－6 个碱基。如果直

接用PCR产物要进行酶切反应，要额外添加6 个碱基

●每条引物的终浓度应为0.1－0.5 μM；引物浓度过高可能导致非特异性引物

结合，并产生非特异性扩增产物

●如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易

发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

●引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。

引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以

被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物

素、荧光、地高辛、Eu3 等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入

突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二

级结构可能。

（5）模板：

●如论是总DNA还是质粒DNA纯度要尽量高。对反应是否成功至关重要。如果组

织量容许，用试剂盒提取总DNA。如果组织量少，用实验室的手提方法。有两个

关键点：第一步加的提取液体积要过量，以便充分混匀。最后一步乙醇清洗要进行

两次；干燥要彻底，管内不能有液体。要用纯水溶解。

●如果DNA溶解不充分，可以在75-85度水浴中处理10-20分钟，可以显著促进溶

解。

●要知道自己模板的浓度。

●模板量根据反应用的DNA Polymerase的要求确定。

●如果PCR DNA产物用于分子克隆，适当提高模板量，这样可以减低PCR反应的

循环数，从而降低引入突变的几率。

（6）DNA Polymerase (DNA聚合酶)

在本实验室，如果是常规检测，目前是有Takara Ex-Taq; 如果是分子克隆，用Takara Prime Star；纯粹学习目的，使用全式金Easy Taq，或是Takara rTaq.

充分理解以下概念

DNA聚合酶的耐热性

DNA聚合酶的保真性

DNA聚合酶的热启动性

（7）建立好反应体系后立即放入已经预热至变性温度的热循环仪中

PCR DNA产物分子克隆应用指南

（1）如果PCR产物不单一，必须进行胶回收。

（2）如果PCR产物唯一，并且是TA克隆，可以利用PCR产物纯化试剂盒直接纯化，取3到5微升纯化后的产物电泳，判断浓度，然后直接同

T载体连接。