流式细胞术应用概述

双色直接染色
设门：选择要分析的细胞群体
设定阴性、阳性范围
第 二 部 分
流式细胞术在临床检测和科研中的应用
一、免疫学检测和科研应用
1、细胞表面分子标记
（以淋巴细胞亚群检测为例）
原理


ห้องสมุดไป่ตู้

人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达 可分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤 细胞。 T淋巴细胞特异性标志为CD3，包括CD4＋和CD8＋T细 胞两个亚群； B淋巴细胞特异性标志为CD19； NK自然杀伤细胞表达CD56或CD16，并且不表达CD3 利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合，再配 多色荧光染料，即可以把淋巴细胞区分为各种亚型。 进而得到各亚群的比例。
细胞表面蛋白抗原 细胞胞浆内蛋白性 抗原 细胞内细胞因子 细胞增殖 细胞内钙离子浓度

流式细胞仪分析数据常见图形：
（二维）点阵图 (Dot Plot)
适用于：双参数分析
流式细胞仪分析数据常见图形：
直方图(Histogram Plot)
适用于： 单参数分析
仅需要观察某
个荧光强度的
变化
流式细胞仪分析图谱
活化的抑制性/杀伤性T细胞 活化的辅助性/诱导性T细胞 活化的抑制性/杀伤性T细胞 在病毒感染的患者中增加; 其增加 意味着HIV患者的预后较差
活化的B细胞
过敏患者中升高 在自身免疫性疾病中升高 慢性 B 细胞白血病及单克隆 B 淋巴 细胞 自身免疫性疾病时降低, 而病毒感 染时升高 CMV(巨细胞病毒)感染的强烈征兆
散射光信号

SSC（侧向散射光）--反应细胞内颗粒多少
FSC（前向散射光）--反应细胞大小
流式细胞仪分析图谱
特征信息－荧光（Fluorescence）信号

FL1 （第一荧光） -FITC(异硫氰酸荧光素） FL2 （第二荧光） -PE（藻红蛋白） FL3 （第三荧光） -PerCP, PeCy5等 PL4 （第四荧光） -APC（藻青蛋白）
是应用流式细胞仪，对处于快速流动液体中的细
胞或生物颗粒进行多参数、快速测量和定量分析，
以及分选的技术。
流式细胞仪特点


多参数测量和分析（散射光和荧光）； 快速测量和分析 每秒可达1000-10000个细胞 分选纯度可达99%以上。 获取的数据分析结果更具有统计学意义； 通常测量的对象如各种细胞细胞必须处在单个细胞悬液 中。此外，也可测量微生物等生物颗粒，或者工合成微 球非生物颗粒
可检测标本




新鲜的血液、骨髓、体液、灌洗液、手 术活检、细针穿刺物等。 冰冻或固定（酒精或甲醛）保存的组织 常规固定/包埋用于组织检查的样本（蜡 块）。 通常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本。 蜡块包埋的标本需进行特殊处理
意义
70%人类癌症中存在着异倍体或细胞周期的改变 DNA倍体和S期比例--指导治疗[2]
恶性黑色素瘤 乳腺癌
甲状腺癌(乳头型) 非何杰金氏淋巴瘤 神经母细胞瘤
CD44 亚 型 非特异 CD44v9 CD44v8-v10 CD44v6 CD44v5 CD44v6 CD44v3/v4, CD44v6 CD44s, CD44v6 CD44v6 CDv3, v6, v9 CD44s
疾病治疗监测
二、流式细胞术在肿瘤学中的应用
肿瘤发生发展
1、DNA倍体和细胞周期分析
G2/M期细 胞,DNA含量开 始增加至4C
细胞周期和DNA倍体分析的原理
1、正常细胞DNA含量稳定在2C水平 2、性细胞DNA含量为1C 3、处于增殖期至分裂期细胞由 2C增加至4C 4、凋亡细胞DNA断裂,含量<2C
Bcl-2在肿瘤组织中的表达
肾脏肿瘤 — 肾癌, 肾盂乳头瘤, Wilms瘤, 肾嗜酸细胞瘤 前列腺癌 B细胞性淋巴瘤 乳腺癌 (43%) 甲状腺癌
nm23
nm23与多种肿瘤的转移及预后相关
肝细胞癌 甲状腺肿瘤 乳腺癌 结肠癌 肉瘤
CD44(CD44s/CD44v)
人 体 肿 瘤 肺癌 胃肠道癌
CD45RA-CD45RO+ CD45RA+CD45RO+ CD4+CD25+CD127/FoxP3+
记忆性T淋巴细胞 活化的T细胞, 感染时升高 调节性T细胞（Treg)
CD4+CD25+CD127-Treg检测
淋巴细胞亚群及功能
活化T淋巴细胞 CD3+HLA-DR+ 名 活化T细胞 称 功 能
S G2/M
Debris Agg reg ates Apoptosis Dip G1 Dip G2 Dip S
Debris Agg reg ates Dip G1 Dip G2 Dip S An1 G1 An1 G2 An1 S
Diploid: 64.50 % Dip G1: 92.45 % at 49.24 Dip G2: 2.30 % at 98.48 Dip S: 5.26 % G2/G1: 2.00 %CV: 3.21 Aneuploid 1: 35.50 % An1 G1: 97.69 % at 58.53 An1 G2: 0.00 % at 123.89 An1 S: 2.31 % G2/G1: 2.12 %CV: 3.14 DI: 1.19
卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，原发部位不明的癌症 --早期 (I/II期)
DNA倍体和DNA指数--预后长期和无病生存期[2]
卵巢癌--晚期
1. Ross JS. DNA Ploidy and Cell Cycle Analysis in Pathology. New York: Igaku-Shoin;1996:47-60 2. The Recommend Medicare National Coverage Policy for Flow Cytometry. HCFA Website,1999
新鲜分离PBMC 加PMA＋Io刺激后6h
测定胞内细胞因子IL-4
和IFN-
Th1/Th2失衡相关疾病

－胞内寄生的病原生物感染性疾病

Th1细胞及其细胞因子⇑ －保护性免疫
Th2细胞及其细胞因子⇑ －发病，如结核病， 或慢性感染
－变态反应性疾病 Th2细胞及其细胞因子 ⇑ －过敏性哮喘等（IgE ⇑）
淋巴细胞亚群检测： T cells, T subsets, NK cells, B cells
T淋巴细胞
淋巴细胞亚群及功能
T淋巴细胞(CD3+) CD3+CD4+ CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29CD3+CD8+ CD3+CD8+CD28CD3+CD4+CD29CD3+CD4+CD8+ CD3+CD4-CD8CD4+/CD8+比值 CD45RA+CD45RO幼稚的/静止的T淋巴细胞 当免疫系统没有能力更新辅助性或抑 制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此 细胞亚群较低 病菌感染时升高 , 但在慢性病毒感染 , 如HIV患者中降低 感染时升高 具有免疫抑制作用 名 称 辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti) 辅助性T细胞(Th) 诱导性T细胞(Ti) 抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc) 抑制性T细胞(Ts) 杀伤性T细胞(Tc) 活化的T细胞 表达 / T细胞受体(TCR / ) 功 能 辅助和诱导细胞免疫和体液免疫 辅助细胞免疫和体液免疫 诱导细胞免疫和体液免疫 抑制免疫反应/杀伤异源细胞 抑制细胞和体液免疫 细胞毒性T细胞 在T细胞恶性增生时升高
FACSCalibur
特点：
光路调节系统固定
自动化程度高
操作简便
使用寿命长
配备1-2根激光 细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析
临床型（台式机）
流式细胞仪可检测的细胞参数
细胞结构

细胞功能

细胞大小 细胞颗粒性程度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量
治疗方案的确定及疗效评价
移植后免疫检测
CD25高于正常值5-10%, 表明即将或已发生排斥 CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染 <0.2时, 必须停用免疫抑制剂 CD2+HLA-DR+增加5-10%, 且不伴有CD25的增加, 提 示巨细胞病毒感染
疾病预防
慢性疲劳, 感染后综合征, 纤维肌痛, 类风湿性关节炎, 过敏等
淋巴细胞亚群与疾病
疾 病 CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 NK
自身免疫性疾病 系统性红斑狼疮 类风湿性关节炎 自身免疫性溶血性贫血 重症肌无力 免疫缺陷病 爱滋病 病毒感染 传染性单核细胞增多症
慢性活动性肝炎 活动性肝硬化
肿瘤 消化道癌, 肝癌, 肺癌 再生障碍性贫血 粒细胞减少症
淋巴细胞亚群检测意义 疾病机理研究 疾病辅助诊断


引起迟发型过敏反应、巨噬细胞活化、局部炎症
刺激来源：病毒、某些细菌

Th2型介导体液免疫反应

引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、
促进I型变态反应（过敏反应） 刺激来源：多细胞寄生虫、过敏原
Th1/Th2细胞
PMA+Ionomycin 刺激4-6hr
流式细胞术检测胞内细胞因子

22.1± 4.15**
45.7± 9.58** 0.43± 0.12** 4.37± 3.31**
34.5± 4.23
32.7± 9.01 1.05± 0.26* 7.59± 5.01**
2、胞内分子流式细胞术检测 （以Th1/Th2细胞因子检测为例）
Th1/Th2细胞
Th1/Th2细胞

Th1型细胞因子介导 细胞免疫反应
－自身免疫性疾病

Th1细胞及其细胞因子 －常为炎性增强的标志

Th2细胞及其细胞因子 －免疫耐受/抑制有关
Th2细胞及其细胞因子⇑ －肿瘤发病，
－肿瘤免疫

Th1/Th2细胞检测意义 发病机制研究 疾病治疗
使用Th1和Th2相关的细胞因子
IFN-治疗麻疯病
用抗Th1和Th2相关细胞因子或其受体的抗体 抗IL-4抗体治疗真菌和寄生虫感染 使用调节Th2/Th2细胞因子平衡的药物: 萨力多胺(Thaliodomide) 治疗巨细胞动脉炎
G0/G1期DNA含量为 2C
S期细胞,DNA含量开始增加,>2C
细胞经荧光染料(碘化丙啶，PI)染色，用流式细胞仪测定细胞 DNA含量，可得到细胞周期三个时相(G0/G1、S和G2/M期)的DNA 含量（％），可以反映细胞的增殖状态和非二倍体（异倍体）的 DNA含量
G0/G1
Diploid: 100.00 % Dip G1: 54.38 % at 46.90 Dip G2: 15.91 % at 91.61 Dip S: 29.71 % G2/G1: 1.95 %CV: 5.23
CD4+HLA-DR+
CD8+HLA-DR+ CD4+CD25+ CD8+ CD25+ CD8+CD38+HLA-DR+ B淋巴细胞(19+) CD19+CD23+ CD19+CD5+ CD19+CD5+CD23+ NK细胞 CD3+CD(16+56)+ CD3+CD57+
活化的辅助性/诱导性T细胞
2、肿瘤相关基因编码蛋白检测
P53 乳腺癌
与病理学分级有关, 并与乳腺癌的淋巴结转移显著相关
胃 癌 与预后相关 大肠肿瘤
早期发现大肠癌
肝细胞癌 与组织分级, 肿瘤预后, 转移及肿瘤大小密切相关
Bcl-2 Bcl-2在正常组织中的表达
造血系统细胞 — 淋巴, 单核细胞等 受激素或生长因子调节的腺上皮 — 前列腺上皮, 子宫内膜等 干细胞或增值细胞 — 皮肤的基底细胞, 肠上皮 寿命长的分裂细胞 — 神经元 胚胎组织
流式细胞术系列讲座之——概述
流式细胞术应用概述
主要内容

流式细胞术的一般介绍 流式细胞术在临床检测和科研中的应用


免疫学检测和科研应用
肿瘤学检测和科研应用


凋亡分析
血液学检测和科研应用 其它应用
第 一 部 分
流式细胞术的一般介绍
什么是流式细胞术？
流式细胞仪(Flow Cytometer): 是集合光电子物理，光电测量技术， 液流技术， 计算机技术等现代高科技技术为一体的细胞测量 和分析仪器。 流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):
淋巴细胞亚群检测意义 鉴别活动期和非活动期SLE
Control （n=20) Active SLE (n=17) CD3 70.4± 5.87 65.8± 10.9 Stable SLE
(n=13)
68.5± 8.95
CD4
CD8 CD4/CD8 NK
35.0± 5.70
27.9± 5.73 1.27± 0.14 17.8± 5. 48