猪圆环病毒检测方法.doc

猪圆环病毒病原检测方法及应用

动医112班

动物科学学院动物医学专业

2012年7月11日

摘要：猪圆环病毒(PCV)是近年受到广泛关注的危害世界养猪业的重要病源之一。PCV具有PCV-1和PCV-2两种基因型。猪圆环病毒（PCV）感染引起的猪圆环病毒病，是以免疫抑制为特征的类病毒性传染病，临床表现主要是由PCV-2引起的仔猪断奶后多系统衰竭综合征。特别是猪圆环病毒2型感染引起的不同生长阶段猪的免疫系统损伤，造成猪机体高度易感，使养猪业蒙受巨大的损失。因此对猪圆环病毒感染的检测技术方法至关重要，且意义重大。文章对就近几年国内外对猪圆环病毒检测技术，包括病毒的分离、电镜观察、聚合酶链式反应（PCR）间接免疫荧光试验、免疫组织化学技术检测、原位核酸杂交试验等进行综述。特别是对猪圆环病毒2型检测技术及应用做了介绍。

关键词：猪圆环病毒；检测方法；应用。

猪圆环病毒（PCV）为圆环病毒科圆环病毒属，是迄今发现的最小的动物DNA 病毒。该病毒基因组为单股环状DNA，无囊膜，粒子呈20面体对称，直径17～20nm。根据PCV的抗原性、核苷酸序列及致病性将PCV分成PCV-1和PCV-2两种基因型。猪圆环病毒是近年来备受人们关注的一种在世界各地广泛存在的慢性疾病，是一系列疾病的总称。自1974年Tischer I等［1］首次发现猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）以来，随着研究的深入，发现PCV-1对猪无致病性，但是PCV1能产生血清抗体，猪群中普遍存在PCV-1，广泛存在于猪源细胞及正常猪体内各组织中。PCV-2对猪有致病性，与传染性先天性震颤（CT）、断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、皮炎肾衰竭综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）及妊娠母猪繁殖障碍相关，其可在猪源细胞培养物中繁殖，不产生细胞病变,易被忽视，因此猪源细胞疫苗或诊断抗体造成潜在的危害。PCV-2导致的断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）造成了很大的经济损失。同时，PCV-2感染一般伴随着猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）感染，造成对猪的免疫系统的损伤，引起免疫抑制，降低猪的抵抗力，造成其他病原（细菌、病毒、真菌和寄生虫）的续发和并发感染，提高病猪的死亡率造成更大的经济损失。由于猪群中普遍存在着PCV 抗体，单一的抗体阳性不能确诊为阳性，确诊必须依靠实验室方法检测出PCV-2抗原或核酸。由于病毒复制困难，所以检测和防控研究非常困难。为此，各国兽医工作者进行了大量的研究，建立了多种高度特异性的病毒学、免疫学和分子生物学诊断方法。文章对目前国内外PCV的检测方法及应用进行综述。

1病毒的分离鉴定技术

猪圆环病毒的分离培养多数是从病猪中采取肺、肝、脾、淋巴结和扁桃体等组织,制成组织匀浆,用氯仿处理除去有囊膜的病毒,接种PK-15细胞,利用氨基葡萄糖短时间处理感染细胞,以促进病毒的增殖。对于PCV-2的分离方法具体是将病死猪组织（淋巴结、肝脏、肺脏、肾脏或脾脏）研磨粉碎，然后与PBS按1:5混合，反复冻融3次，离心，去上层清液，用氯仿抽提，除去有囊膜的病毒

（如PRRSV）。取滤夜接种于PK-15猪肾细胞，盲传10代用300mmol/L的D-氨基酸葡萄糖处理30min，用间接免疫荧光试验及电镜观察病毒颗粒。吕艳丽［2］等从北京、河北分离了3株PCV-2，并对其中的2株进行了测序，序列分析比较发现，它们与欧美分离株具有很高的同源性。郎洪武等［3］用猪肾传代细胞分离到了2株圆环病毒。崔尚金等从我国的22个省市分离到了32株猪圆环病毒，并对其中6株进行了测序，呈送到GenBank。另外，还有很多研究人员从各地分离到多株猪圆环病毒。此外，病毒分离费时费力，不适合疾病的快速诊断。

2电镜观察

电镜下可以观察到一种较小病毒，是猪圆环病毒特有的直径约为17nm的球形结构，以及大量不同形态的胞浆内包含体。

3聚合酶链式反检测

聚合酶链式反应（PCR）作为一种快速、简便、特异的诊断方法，目前为病毒学诊断、分子生物学实验最常用的技术，其优点为敏感、特异、快速、准确。在PCV的检测方面应用广泛，且发展了很多改良技术。

3.1多重PCR检测

Huang C I等［4］建立了一种简单的多重PCR法，可用于对PCV的检测和定型。该方法设计了两套引物，是根据PCV核酸上的ORF1和ORF2设计的。Calasamiglia M等［5］建立了一种多重PCR法，可对PCV进行检测和定型。作者根据PCV-1和加拿大PMWS猪中分离的PCV-2的ORF1和ORF2序列设计两套引物，这两套引物都可以对PCV进行测序和定型。郎洪武等［3］根据PCV中的特异性和PCV-2的特异性，设计两对PCR引物，进行多重PCR检测PCV。一对引物扩增出的片段具有PCV 中的特异性,扩增区域是相对保守的ORF1部分核苷酸片段,大小约为900bp。另一对引物扩增出的片段具有PCV-2型的特异性,扩增区域呈可变性相对较大的ORF2 部分的核苷酸片段,大小约为470bp。Kim J等[6]在2003年建立了石蜡包埋组织中同时检测PCV-1、PCV-2和PPV多重套式PCR法,检测了人工感染病例和自然感染病例,结果与原位杂交方法完全一致。

3.2定量竞争性PCR检测

定量PCR是根据PCR的产物量来推断其原始模板量。Liu Q等[7]建立了竞争性PCR方法检测血清中的PCV的DNA。选取PCV-1和PCV-2的ORF2中变异性高的区段设计两对型特异性引物,并引入一个外源片段的重组质粒,以此作为竞争性模板,用上述两对引物扩增出的PCV-1或PCV-2片段能够与野毒株的扩增片段相区别。当倍比稀释的已知浓度的质粒DNA和待测DNA共同的PCR产物的电泳条带亮度相同时,便可以推算出待测DNA的浓度。崔尚金等[8]运用此方法在试验过程中采用内标竞争模板,竞争模板和目标模板共用一个反应体系,不仅降低了非内标性模板不同PCR反应管间的差异,而且在对样本进行质控监测,排除了假阴性结果。

3.3复合PCR检测

复合PCR是一种特殊的PCR技术,即在同一反应体系中加入多对引物,扩增多个基因片段,此法方便快捷,已广泛用于医学临床诊断。芦银华等[9]应用复合PCR,在同体系中用3条引物扩增PCV两种血清型的DNA片段,从而达到PCR扩增一次就可检测鉴别PCV-1和PCV-2的目的。试验从PK-15细胞中扩增出了PCV-1和PCV-2特异的基因片段,表明复合PCR方法的建立,为PCV的检测、分型及临床PMWS的诊断提供了有效的工具。朱军莉等[10]采用复合PCR,对浙江、上海等地的猪场, 具有明显的“高热综合征”临床表现猪的淋巴结进行检测,发现PCV-2的