DNA多态性及其分析技术

• 二.核酸探针的标记
• 将准备作为探针的DNA片段纯化，用同位素（如32P）或 非同位素标记，经纯化后使用。
• 三.杂交显示
• 将标记好的探针与硝酸纤维膜或尼龙膜上的单链DNA杂 交，洗膜以后进行放射自显影或加入酶的反应底物显色， 再对显示出来的谱带进行分析。
• 影响RFLP的几个因素 • 一.限制性内切酶
• 由于控制性状的基因碱基组成上的不同造成的多态性。 • 采用等位基因特异性探针（ASO或SSO探针）或限制酶 切消化进行分析。 • 如人类白细胞抗原（HLA）系统，编码HLA-DR抗原的位 点有超过200个等位基因。
• 二.重复序列多态性
• 串联重复序列多态性（variable numbers of tandom repeats,VNTR）：
RFLP技术图解 抽提DNA
（从血或组织）
培养细菌 质粒纯化
人工合成探针
纯化探针
限制性内切酶消化
标记探针（同位素或非同位素）
琼脂糖凝胶
Southern转移、固定
预杂交
杂交
反射自显影或显色后 分析结果
洗膜
• RFLP技术的基本步骤 • 一.靶DNA的准备
• 先将人基因组DNA抽提出来，选用合适的限制性内切酶 酶解基因组DNA，将酶解出来的具有各种长度的DNA片段 在琼脂糖凝胶上电泳分离，使其按片段的长短排列，将 DNA片段变性后转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上（称为 印迹转移，即Southern blot），并固定在这些载体上 面。
• 三.性染色体多态性
• X染色体的重复序列多态性 • Y染色体的特异性片段多态性。
• 四.线粒体的DNA多态性
• 人线粒体DNA的D环 • 两个无关个体间，完全相同的可能性只有 0.27%。
第三节 DNA多态性分析技术
• 一.RFLP分析技术
• 基本原理
• 限制性酶切片段长度多态性技术（restriction
• 分析DNA的多态性才能真正深刻地揭示生物的 多态性。
基因及相关 序列 20%～30% 人类基因组 30亿碱基对
编码序列 ＜10%
中度或高度 重复序列 20% ～30%
簇状重复 60%
非基因序列 70%～80%
单一数或 低拷贝序列 70% ～80%
人类基因组序列概况
பைடு நூலகம்
第二节 DNA多态性的分类
• DNA是遗传信息的物质基础，因而是反映个体 间差异的最本质东西。DNA序列组成的个体特 异性主要表现为下列类型的DNA多态性。 • 一.基因多态性
• 三.分类
• 遗传多态性主要可分为遗传表型的多态性和 DNA的多态性两大类。
• 由遗传控制表现出来的性状就是遗传表型。 • 检测遗传表型多态性有其局限性： • ①遗传表型的多态性只反映出编码基因的部分 变异。后者只占人基因组总DNA的10%（＜10%）。基
因及基因相关序列占总DNA的25%。 • ② DNA序列中的同义突变不会引起表型的改变。 这时检测表型就不能发现编码基因中存在的变异。 • ③基因的表达会有变异，基因型完全相同的生物体 在不同的生长条件下可能有不同的表型，靠检测表型 多态性来推断基因有时会出现错误结论。
• 影响RFLP图谱的重要因素。 • 市售常见的有100多种。 • 星号*活性即非特异性酶解活性。反应液中甘油、乙醇 浓度及被酶解DNA的质量和浓度。
• 二.核酸探针
• • • • 不同的DNA探针会显示出不同类型的RFLP图谱。 1.基因探针 人基因组中某一基因的一个片段。 常用于研究人类遗传性疾病。
第一节
• 一. 定义
多态性概述
• 不同种的生物以及同一种生物的不同个体之间都 存在着许多差异，称为生物的多态现象，即生物 的多态性（polymorphism）。 • 生物群体中个体间的变异有的是由环境因素，如 营养、气候等造成的；有的则是由遗传因素造成 的。由遗传因素造成的变异形成一系列的多态性， 称为遗传多态性（genetic polymorphism ）。
• ①相同的核心序列，不同的个体重复的次数不同。 • ②不同的重复序列，其核心序列的组成会不同。 • ③在核心序列之间，不同的个体间会存在有无插 入小段DNA或插入的片段长短不同的差异。
• 因此，两个无关个体的VNTR的变异能达到 完全个体特异的程度，这是DNA指纹形成的 基础。 • 中度重复的散在重复序列多态性。 • 遍布哺乳动物基因组中
fragment length polymorphism，RFLP）：用某种特 定的限制性内切酶消化不同的DNA片段，由于DNA的碱 基组成不同，就会产生不同长度的酶切片段。这样采 用合适的限制性内切酶消化待分析的DNA片段，就能根 据切出来的片段是否长度一致来推测其DNA序列是否相 同，然后用标记好的相应的DNA探针与这些片段进行杂 交，显出的图谱就可以反映出基因组DNA碱基序列组成 是否存在差异。这一技术的基础是通过核酸的限制性 酶切片段长度多态性来揭示DNA碱基序列组成的不同。
• 如1985年，Jeffreys等发现的高度重复的小卫 星DNA探针，可揭示人类的DNA序列的多态性， 并且在无关个体之间这类多态性相同的机会极 微（只有3×10－11），称为DNA指纹。 • 可用于个人识别和亲子鉴定，人类学的研究。
• 4.人工合成的寡核苷酸探针
• 探测人基因组中的散在重复序列，也可用于个 体特异性研究。
• 影响RFLP的几个因素 • 2.随机探针
• 从人基因组DNA中随意挑选出一个DNA片段，其功能并 不知道。 • 采用统一的命名法：D后为来源之染色体的号码，S为 单拷贝（NF代表有多个片段），最后是分配给定的序 号。如D14S1等。 • 可进行疾病基因连锁分析。
• 3.重复序列探针
• 基因组中的重复序列，可同时揭示整个基因组中许许 多多位点的DNA序列的多态性。
• 二.标准
• 发生遗传分离的基因座位（locus）具有两个 以上等位基因时，其最常见的等位基因的频率 不超过0.95或0.99时，这个基因座位就被认为 具有多态性。在某些时候，一个基因位点上只 由一个基因占据，但有时这个位置上缺乏这一 基因，这时就会出现“有”和“无”两种情况， 被称为二态性（dimorphism）。