第十二章蛋白质药物的分析

超离心沉降速度
? 原理：在转速较高时（ 50000 至60000 转/ 分 钟） ，均匀分布在溶剂中的蛋白质分子以一定 的速度移向离心池底部，并形成一个界面， 分 子量越大的物质，界面移动越快 。
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第三节 蛋白质药物的分析
? 一、蛋白质纯度测定 ? 二、蛋白质分子量测定 ? 三、蛋白质药物的含量测定 ? 四、蛋白质组成氨基酸的分析
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一、蛋白质纯度的鉴定方法
1 、层析 2 、电泳 3 、免疫化学法 4 、其它方法（分光光度法，酶活力，超
速离心沉降）
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二 、蛋白质分子量测定
? 超离心沉降速度
? 氨基酸对照品。
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实例：L-精氨来自百度文库——高氯酸滴定法
? 取本品约 0.1g ，精密称定，置 50ml 烧杯中， 加冰醋酸 10ml 与醋酸汞试液 5ml ，缓缓加热 溶解。
? 放冷后，用 高氯酸液 （0.1mol/L ）滴定，并 将滴定的结果用空白试验校正。
? 每 1 ml 的 高 氯 酸 液 相 当 于 1 0. 5 3 mg 的 C6H 14 N 4O2·HCl 。
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（四）甲醛滴定法
? 在pH 中性下，甲醛迅速与氨基酸上的氨基结 合，使平衡 向右移动 ，促进氢离子释放，使 溶液酸度增加。
? 每释放出一个氢离子，相当有一个 氨基氮
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（五）非水溶液滴定法
? 非水溶液滴定法：是氨基酸在 冰醋酸中 用高 氯酸的标准溶液 滴定其含量
? 酸碱的质子学说：一切能给出质子的物质为 酸，能接受质子的物质为碱。
? 离心沉降平衡
? 凝胶过滤层析
?
(gel filtration chromatography )
? SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE ）
?
SDS- polyacrylamide gel electrophoresis
? 梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳法
?
（gradient PAGE ）
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酸、苯丙氨酸，在紫外区有最 大吸收 ? 红外光谱鉴别 ：压制成溴化钾 片，在4000 ～667 cm -1 范围 内测定吸收图谱
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二、氨基酸定量
? （一）茚三酮法 ? （二）三硝基苯磺酸法 ? （三）铜复合物紫外吸收法 ? （四）甲醛滴定法 ? （五）非水溶液滴定法 ? （六）双波长分光光度法 ? （七）导数分光光度法 ? （八） HPLC法
? 弱碱在酸性溶剂中碱性显得更强 ，而弱酸在 碱性溶剂中酸性显得更强。
? 适合成品测定，测定范围是几十毫克
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（六）双波长分光光度法
? 消除共存组分干扰
? 等吸收波长的选择 :复方氨基酸 注射液在320 ～280 nm 范围内， 只有色氨酸和酪氨酸 有吸收度。
? 酪氨酸在 280 ，303.2 波长处吸 收度相等，选用2 80 与 303.2nm 为等吸收波长 。
电点（pI ）， 生理条件下多数以负离子形式存在。
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茚三酮反应
? 茚三酮在酸性溶液中与 α－氨基酸共热，引起 氨基酸氧化脱氨、脱羧反应，最后 茚三酮与反 应产物－氨和还原茚三酮 反应生成 紫色物质。
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二、蛋白质的性质
? 高分子有机物 ? 两性电解质 ? 双缩脲反应 ? 福林酚反应 ? 紫外吸收
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氨基酸与蛋白质药物的分析
第一节 概述 第二节 氨基酸类药物的分析 第三节 蛋白质类药物的分析
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第一节 概述
? 一、氨基酸的性质 ? 二、蛋白质的性质
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一、氨基酸的性质
? 具有旋光性 ? 光吸收：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸，在近紫外
区有最大吸收。 ? 酸碱性：两性电解质，净电荷为零时的 pH 称为等
生成深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成 正相关
? 660nm 测定，灵敏度比双缩脲法高 100 倍 适于微量蛋白的测定。
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第二节 氨基酸类药物的分析
? 一、氨基酸鉴别 ? 二、氨基酸定量
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一、氨基酸鉴别
? 茚三酮：溶液均显蓝紫色。 ? 旋光性： ? 薄层色谱鉴别法 ： ? 紫外光谱鉴别 ：酪氨酸、色氨
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（一）茚三酮法
? 茚三酮在酸性条件下和氨基酸反应，氨基酸被氧化 分解生成醛，放出氨和二氧化碳， 还原型茚三酮 。
? 还原型茚三酮与氨及另一分子茚三酮缩合生成蓝紫 色的物质，最大吸收值波长 570 nm 。
? 范围：0.5-50 μg
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（二）三硝基苯磺酸法
? TNBS 在偏碱性的条件下与氨基酸反应，先 形成中间络合物 。
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标准曲线的绘制
? 精密吸取 1.2 ，2.0 ，3.0 ，4.0 ，5.0 ， 6.0ml 色氨酸对照品溶液，置100 ml 量瓶中，用氢氧化钠液稀释至刻度， 在280 ，303.2nm 处分别测定，计算 吸收度差值△A 。
? 在0.5 ～3.0mg/100ml 范围，浓度与 吸收度差值呈良好性关系。
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（七）、导数分光光度法
? 选定导数光谱波长范围为 322 ～270nm ，按导数 分光光度法测定色氨酸、酪氨酸的一阶，二阶和三 阶导数光谱。
? 在三阶导数光谱 中色氨酸在 287 、284 、280nm 有三个导数光谱峰，而酪氨酸在零线上，选定三阶 导数分光光度法。
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八、HPLC法
? 对于多种氨基酸配制成的氨基酸注射 液，可用HPLC 进行含量测定。
蛋白质为高分子有机物
? 蛋白质水溶液具有亲水胶体的性质，还 具有扩散和沉降作用，粘度大和不透过 半透膜等
? 沉降常数（S）： ? 扩散常数（D）： ? 粘度：在一定溶质浓度下，取决于溶质
的分子量和形状
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蛋白质为两性电解质
? 蛋白质分子至少具有一个自由氨基 和一个自由羧基，具有两性解离性 质
? 蛋白质电泳、离子交换
? 酸性溶液中，中间络合物转化成 TNB- 氨基 酸，吸收值移至 340nm 处。
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（三）铜复合物紫外吸收法
? 在合适的 pH 条件下，二分子 α- 氨基酸与一分子 铜离子形成 氨基酸-铜复合物 。
? 复合物呈蓝色，除了在 620nm 有吸收峰外，在 230nm 有最大吸收 。
? 蛋白质水解速度和 水解程度的测定。
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双缩脲反应
? 双缩脲试剂的成分 :碱性硫酸铜溶液 ? 碱性溶液中， 双缩脲(H2NOC—NH—CONH2)能与
Cu2+作用，形成紫色或紫红色的络合物
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Folin －酚反应（Lowry ）
? 包括两步反应： ? （1 ）在碱性条件下，与铜试剂作用生成 蛋
白质－铜络合物 ； ? （2 ）此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，