蛋白质药物PEG化学修饰指南
聚乙二醇(PEG)修饰剂选择指南
性质聚乙二醇(PEG)，又称聚氧乙烯(oxyethylene)或聚环氧乙烷(PEO)，是一种合成的亲水生物相容性聚合物。
分子量＜100,000的通常被称为PEG，而分子量＞100,000的PEG聚合物被归类为PEO。
聚乙二醇是通过环氧乙烷开环聚合反应合成的，PEG 可以聚合成线性、分支、y形或多臂等几何形状。
PEG聚合物是两亲性的，可溶于水和许多有机溶剂(如二氯甲烷、乙醇、甲苯、丙酮和氯仿)。
低分子量(Mw <1,000)的聚乙二醇是粘稠无色的液体，而高分子量的聚乙二醇是蜡质、白色的固体，熔点与分子量成正比，熔点的上限约为67℃。
应用聚乙二醇无毒，通常无免疫原性，被FDA批准为可用于药物配方、食品和化妆品中作为辅料或载体。
大多数分子量＜1000的PEG可快速从体内清除，清除率与聚合物分子量成反比。
此外，PEG聚合物末端可连接多种官能团，使聚合物具有更多的功能。
因此，PEG在生物医学研究中具有广泛应用:生物接合、药物传递、表面功能化、组织工程以及许多其他应用。
PEG偶联是药物靶点如肽、蛋白质或寡核苷酸等与PEG的共价生物偶联，进而优化药代动力学特性。
在药物传递中，PEG可作为抗体-药物偶联物(ADCs)的连接物，或作为纳米颗粒的表面涂层，以改善系统药物传递。
PEG水凝胶是一种水膨胀的三维聚合物网络，它能抵抗蛋白质的粘附和生物降解。
PEG水凝胶是由PEG末端基团反应交联而成，通常用于组织工程和药物传递。
选择指南功能*单官能团聚乙二醇，包含一个化学反应端，可用于聚乙二醇化、表面接合和纳米粒子涂层*双官能团聚乙二醇，含有两个活性末端的PEG，包括同双官能团PEG、异双官能团PEG，有利于水凝胶的接合和交联反应*共价偶联:具有活性末端基团额PEG，如n-羟基丁二酰亚胺酯、巯基或羧基等，可以共价偶联到相应的官能团。
结合化学反应性质决定了每个分子的结合位点和PEG数量。
*链接化学需要带有叠氮或炔反应基团的PEG。
蛋白质的化学修饰
PEG修饰蛋白及其应用
被修饰蛋白种类 无基质牛血红蛋白
SOD
L-ASNase Bovine IL-2 TNF-a
抗肿瘤抗体 Β-葡糖苷酸酶抗体
修饰目的 延长血浆半衰期,降低肾毒性
延长血浆半衰期 降低免疫原性
降低免疫原性 降低免疫原性
增加水力动力学半径 增加抗肿瘤效能,降低毒副作用
肿瘤定位 增加稳定性,改善药代动力学特性
2 降低抗原性和免疫原性
通过PEG修饰来消除免疫反应活性,将异源性蛋白转化 为非免疫原性的药用蛋白,主要是利用无免疫原性的PEG分 子链与蛋白表面的基团相偶联,进而在蛋白表面形成一道屏 障,将暴露的抗原结合位点屏蔽起来。分子构型独特的梳状 PEG具有更强的屏蔽功能,因而在这方面的应用的内毒素性休克样综合征。要将其转化为一种有 效的抗肿瘤药物必须有效地降低毒副作用,PEG修饰正是为 达到这一目的。研究表明,利用mPEG 5000对TNF-a进行化 学修饰,通过对修饰条件的优化处理,不仅能够有效减少毒副 作用,还可提高其抗肿瘤活性。当赖氨酸残基被修饰的程度 分别为29%和56%时,其抗肿瘤活性分别增加了4倍和100倍。 与天然TNF-a相比,修饰产物的分子量明显增大,延长了药物 的有效作用时间,降低了毒副作用,促进了它作为抗肿瘤药物 的应用。
由于PEG无毒,具有良好生物相容性和血液相容性, 使它成为一种被广泛使用的生物修饰材料。对于各种 具有药用潜能的蛋白来说,采用PEG修饰的目的主要有 以下三个方面:(1)增加稳定性,延长血浆半衰期;(2)降低 免疫原性和抗原性;(3)降低毒副作用。
1 增加稳定性和延长血浆半衰期
一些以注射方式使用的药用蛋白,由于在血液中存留的 时间过短,在很大程度上限制了其正常药效的发挥。通过 PEG修饰,一方面增加了分子量,降低了肾脏的排泄速率;另 一方面,偶联的PEG链在蛋白分子表面产生空间位阻效应,减 弱了血液中各种水解酶对蛋白的水解作用,从而有效地延长 了蛋白在循环系统内的保留时间。
聚乙二醇修饰重组人生长激素的研究
聚乙二醇修饰重组人生长激素的研究作者：马妍春，杨秀云，李磊姣，李云辉，高莹来源：《吉林省教育学院学报·上旬刊》 2017年第12期摘要：化学修饰是蛋白质药物的一种有效修饰方法。
使用聚乙二醇（PEG）修饰人生长激素（rhGH），是提高rhGH 半衰期的重要手段之一。
本文重点综述PEG 修饰rhGH 的方法及其研究进展。
关键词：重组人生长激素；聚乙二醇；化学修饰doi:10.16083/ki.1671—1580.2017.12.052中图分类号：TQ464 文献标识码：A 文章编号：1671—1580（2017）12—0172—03一、聚乙二醇（PEG）聚乙二醇（PEG）是平均分子量在200kD～8000kD 或8000kD 以上的乙二醇高聚物的统称。
PEG不易挥发、水溶性好、无味。
常见的PEG分为线性和分枝的，末端带有羧基，而且具有伯醇性质，易于进行酯化或醚化反应。
末端基团活化后的PEG结构具有多样性，通过共价键合的方式修饰各种蛋白质类药物，可以有效地消除或降低蛋白质药物的免疫原性。
1991 年，FDA批准了首例PEG修饰的长效腺苷脱氢酶（商品：PEG-ADA）上市。
2000 年，Schering-Plough 公司制备的PEG 化的干扰素α-2b 获得批准上市（产品：PEG-Intron）。
2002 年，Roche 公司生产的PEG化干扰素α-2a（产品：PEGASYS）获得FDA批准上市。
同年，Amgen公司生产的重组人粒细胞集落刺激因子（产品：Neulasta）也被FDA批准上市。
上述这些成功上市的产品证明了PEG 修饰蛋白质药物的可行性和市场地位。
经过PEG 修饰后，很多蛋白质高分子的抗蛋白水解酶、抗抑制剂等失活因子的能力有所提高，体内半衰期比未修饰前明显提高。
许多蛋白质在体内的药物动力学性质发生了明显改变，血浆半衰期延长，肾清除率降低。
此外，某些物理和化学因素会破坏蛋白质分子的空间构象，导致其生物活性的丧失和一些性质的改变。
蛋白质药物PEG化学修饰指南
蛋白质药物PEG化学修饰指南蛋白质是生物体内重要的功能分子，具有广泛的生物学活性和药理学特性。
然而，许多蛋白质药物在药理特性和药代动力学方面存在一些局限性，例如短半衰期、不稳定性和免疫原性。
为了克服这些问题，PEG（聚乙二醇）化学修饰被广泛应用于蛋白质药物的研究和开发中。
PEG化学修饰可以通过共价结合PEG与蛋白质分子来改善药物的性能，如增加药物在体内的半衰期、提高稳定性和降低免疫原性。
在PEG化学修饰指南中，主要涉及以下几个方面：1.PEG化学修饰的方法：- PEGylation是指将PEG与蛋白质以共价键合的方式连接，一般是通过反应PEG基团与蛋白质表面的氨基酸残基（如Cys、Lys等）进行连接。
- PEG化学修饰的方法有很多种，包括活性酯化、磺酸化、碳酰二亚甲基化等。
不同的化学修饰方法可以实现不同的PEGylation效果。
2.PEG化学修饰的影响因素：-PEG的分子量和结构对修饰效果有显著影响。
PEG的分子量可以影响药物的溶质性、药物在体内的清除速度等。
此外，PEG的结构也会影响修饰的效果，例如PEG的链长、支链结构等。
-蛋白质的性质也会影响PEG化学修饰的效果。
蛋白质的结构、表面氨基酸残基的分布和可修饰性等都会对修饰效果产生影响。
3.评价PEG化学修饰的方法：-对PEG化学修饰效果的评价可以从多个方面进行，包括药物的稳定性、溶质性、免疫原性和药效等。
-其中，评价药物的稳定性可通过测定药物在不同环境条件下的稳定性来进行；溶质性的评价可通过测定药物的水溶性和溶解度来进行；免疫原性的评价可以通过动物实验和免疫学方法进行；药效的评价则需要进行体内体外的药效研究。
4.PEG化学修饰的应用：-PEG化学修饰可以用于改善蛋白质药物的稳定性，提高药物在体内的半衰期，并降低免疫原性。
这使得药物能够更好地在体内发挥药理学作用。
-由于PEG的降解机制复杂，PEG化学修饰也可以用于控制药物的释放速率和疗效。
这对于长期治疗和控制药物血浆浓度非常重要。
PEG修饰化学药物的新方法
PＥG修饰化学药物的新方法庄小璐宋春梅*薛海丽张以群（华东师范大学化学系上海 20０062)摘要:本文以烟酸为模型药物，把烟酸以可降解的酯键连接到聚乙二醇(PＥG）上,通过酯键的降解以达到小分子药物的缓释效果。
对于所合成的大分子前药进行纯化，纯化后的大分子前药用ＩR，1H-NMＲ进行表征。
关键词:聚乙二醇烟酸小分子药物大分子前药修饰把小分子药物连接到高分子上以获得具有缓释或靶向性能的高分子药物的研究一直受到人们的关注[1-2]。
在本文中,以烟酸为模型药物，经二氯亚砜氯甲酰化后,键合于聚乙二醇上,获得PEG修饰的高分子药物。
聚乙二醇(PEG)无毒、无致畸性、无免疫原性，具有非常好的水溶性和生物相容性,当偶联药物分子时，可以将其优良性质赋予修饰后的药物分子,改变它们在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少药物的酶解,避免在肾脏代谢中很快消除，并使药物能被免疫系统细胞识别［3]。
烟酸是临床上有意义的小分子药物,它是目前一种广谱调节血脂药物,可用于治疗混合型高血脂症，高血浆蛋白症等多种病症，但存在诸如诱发溃疡病、加重糖尿病及痛风等许多副作用，从而限制了它的临床应用。
把烟酸以可降解的酯键连接到ＰEG上,期望通过生成的大分子的两亲性而减少该药的毒副作用,同时又通过酯键的水解达到药物的缓释。
以二氯亚砜为交联剂,反应十分完全，提高了目标修饰物的纯度,便于纯化。
1.实验部分１.1 原料聚乙二醇4000（国药集团化学试剂有限公司ＣP)经90℃油浴抽真空5小时,干燥除水;二氯亚砜（上海凌峰化学试剂有限公司,AＲ,直接使用)；苯（上海试剂一厂,AR)用4Ａ分子筛放置过夜，氮气氛下蒸出放入分子筛备用;烟酸(国药集团化学试剂有限公司，CＰ）用蒸馏水重结晶两次；无水乙醚(常熟市杨园化工厂）;三乙胺(国药集团化学试剂有限公司,AＲ）用无水CａCl2放置过夜，氮气氛下蒸出放入分子筛备用。
1.2 烟酸－氯甲酰化物的合成取烟酸1.24g(10mｍol）,于５０ｍl圆底烧瓶中,加入精制的二氯亚砜3ml(40 mmol），在磁力搅拌下慢慢滴加，滴加完毕,70℃油浴,反应1h,反应有气泡产生，待反应混合物中无固体和不再有气泡产生时,停止反应。
蛋白质的PEG化学修饰
bin at Cys293(beta):correlation be-
tween the colligative properties of the
PEGylated protein and the length of
蛋白质上的修饰基团多为亲核性的, 其 活 性 的 顺 序 是 :巯 基 >α -氨 基 >ε -氨 基>羟 基 。所 以 可 以 选 取 能 够 特 异 性 PEG修 饰 剂 对 数 目 稀 少 巯 基 进 行 定 向 修 饰 。此 类 PEG修 饰 剂 主 要 有 :
图 １ 三聚氯氰 － Ｐ Ｅ Ｇ 对蛋白质氨基的修饰
由于高锰酸钾过量时,处理后的水会 显 粉 红 色 。因 此 ,我 们 随 时 观 察 滤 前 水 的 变 化,要求值班人员每半个小时取滤前水水 样进行过滤,观察其颜色。
我们曾经考虑在水库出水口投加高锰 酸钾,这样,就可以把进厂水中的溶解性锰 含 量 控 制 在 0.1mg/L以下,但 由 于 我 们 的 输配水管在途中有农民灌溉用,所以,也只 能把投加点放在配水井。
中锰去除而保证水质(见表3)。
酸钾。
５ 投加高锰酸钾需要注意的问题
若高锰酸钾投加量超过需要量,处理 后的水会显粉红色,这是需要避免的,所以 必 须 严 格 控 制 。高 锰 酸 钾 投 加 量 允 许 在 一 定的安全幅度内变动,在安全幅度内,处理 水 的 性 状 可 保 持 良 好 。此 安 全 幅 度 的 大 小 随 水 中 PH值 而 变 ,PH值 越 高 ,幅 度 越 宽 ,且 所需投加量也相对减小。
蛋白质药物聚乙二醇修饰技术
蛋白质药物聚乙二醇修饰技术简介近年来，随着蛋白质药物的聚乙二醇修饰技术的发展，聚乙二醇化药物得到了广泛的应用。
目前已有十余种聚乙二醇修饰的蛋白药物上市，临床医疗效果优异，市场上也表现出了良好的业绩。
同时还有数十种聚乙二醇化蛋白质药物处在临床或临床前研究阶段。
聚乙二醇简介聚乙二醇（poly(ethylene glycol)）是一类聚醚类聚合物。
随着平均分子量的不同，性质也产生差异。
当分子量小于1000 Da时，聚乙二醇是无色无臭粘稠的液体，高分子量的聚乙二醇则是白色固体。
固体聚乙二醇的熔点正比于分子量，逐渐接近67℃的极限。
聚乙二醇分子中含有大量乙氧基，能够与水形成氢键，具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，能改变药物在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快被消除，并使药物能被免疫系统的细胞识别。
聚乙二醇修饰的蛋白质一般构象不会改变，其结合物的生物学活性主要由结合物的蛋白质部分产生。
聚乙二醇具有免疫学惰性，即使分子量高达5.9×106 Da，本身的免疫原性也很低。
临床上使用聚乙二醇修饰蛋白治疗时，未发现抗聚乙二醇抗体产生。
聚乙二醇是经美国食品药品管理局（FDA）批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。
聚乙二醇修饰又称分子的PEG化（pegylation），是20世纪70年代后期发展起来的修饰方法。
将活化的聚乙二醇与蛋白质分子相偶联，影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变：化学稳定性增加，抵抗蛋白酶水解的能力提高，免疫原性和毒性降低或消失，体内半衰期延长，血浆清除率降低等。
聚乙二醇修饰反应类型在20种构成蛋白质的常见氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰。
活化的聚乙二醇通过与蛋白质分子上的氨基酸残基进行化学反应而实现与蛋白质的偶联。
这些氨基酸残基上的反应性基团多呈亲核性，其亲核活性通常按下列顺序依次递减：巯基>α-氨基>ε-氨基>羧基（羧酸盐）>羟基。
聚乙二醇在药物制剂中的应用
聚乙二醇在药物制剂中的应用聚乙二醇别名聚氧乙烯醇或聚氧乙烯二醇，系环氧乙烷与单乙二醇（或双乙二醇）在碱性催化剂催化之下聚合而成，分子质量因聚合度不同而异，通常在200～35 000之间，PEG 的性质随分子质量而变化，目前常见的PEG种类有PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000等。
药物溶剂PEG200、PEG300、PEG400、PEG600 系无色、略有微臭的粘性液体，化学性质稳定，安全低毒，故常作为药物的溶剂。
另外，为了增加难溶性药物的溶解度，常使用潜溶剂即乙醇、甘油、丙二醇、苯甲醇、聚乙二醇等与水组成的混合溶剂。
用于软胶囊剂软胶囊剂的囊材多以一定比例的明胶、增塑剂和水等组成，因此对蛋白质性质无影响的药物和附加剂均可填充。
如各种油类、液态药物、药物溶液、药物混悬液和固体药物等。
由于低分子质量PEG 能与水混溶，故是水溶性药物和某些有机药物很好的溶剂，如硝苯地平软胶囊。
目前，软胶囊剂多为固体药物粉末混悬在油性或非油性（PEG400 等）分散介质中包制而成。
另有报道，水合氯醛应用聚乙二醇作为溶剂可大大降低它对明胶蛋白的分解作用用于注射剂由于PEG200～PEG600 可提高难溶性药物的溶解度且对水不稳定药物有稳定作用，故可作为注射用溶剂。
单一以PEG 作为注射用溶剂的注射剂并不多见，如噻替哌注射液以PEG400 或PEG600作为溶剂，可避免噻替哌在水中的聚结沉降作用；盐酸苄去氢骆驼莲碱注射液以PEG200 作为溶剂，安全稳定，贮放2 a 保持不变。
但一般多用混合溶剂（潜溶剂），如以V (PEG300): V(苯甲醇): V (丙二醇) = 80:5:15 时可作为质量分数为5 % 黄体酮或睾丸酮注射液的混合溶剂，此 2 种注射液经肌肉注射后，与体液接触即在局部析出药物沉淀，形成药物仓库，逐渐从组织中释放，具有长效作用，售商品有病毒灵注射液、安乃近注射液、痢菌净注射液、穿心莲注射液、菌毒杀星注射液等。
PEG的修饰作用
PEG的修饰作用京江学院药物制剂0702 3071158037 赵艳华摘要：聚乙二醇修饰即PEG化，是将活化的PEG通过化学方法以共价键偶联到蛋白质或多肽分子上。
自Davis1977年首次用PEG 修饰牛血清白蛋白以来，PEG修饰技术广泛应用于多种蛋白质和多肽的化学修饰，多个PEG修饰药物上市或在临床研究中。
PEG修饰具有半衰期延长、免疫原性降低或消失、毒副作用减少以及物理、化学和生物稳定性增强等。
关键词:PEG(聚乙二醇)；修饰高分子聚乙二醇（PEG）由于其毒性小、无抗原性、具有良好的两亲性，且生物相容性已获FDA认可，对蛋白质的改造具有无可取代的优势。
聚乙二醇化修饰技术通过共价键，将聚乙二醇与被修饰药物耦联，改善药物的理化性质和生物学活性，这种技术现已广泛应用于蛋白质(肽类)、酶、抗体及小分子药物。
1 PEG化学结构及性质1.1 PEG化学结构结构式CH2（OH）-（CH2CH2O）n -CH2OH1.2 PEG性质【1】聚乙二醇系列产品通常情况下溶于水和多种有机溶剂，不溶于脂肪烃、苯、乙二醇等，不会水解变质，有广泛的溶解范围和优良的相容性、很好的稳定性、润滑性、成膜性、增塑性、分散性等。
系低毒物质，且无刺激性，属非离子型聚合物。
2 聚乙二醇修饰剂根据化学修饰剂与蛋白质之间反应性质的不同，修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等类型，对蛋白质进行氨基、巯基和羧基等侧链基团进行化学修饰。
根据被修饰化合物包括蛋白质、多肽、单克隆抗体分子片段、以及小分子化合物等的不同分子量大小、分子结构以及其理化特性，公司采取不同的聚乙二醇化技术方法对这些化合物进行修饰【2,3】。
2.1随机修饰随机修饰蛋白质多以赖氨酸的ε-NH2或α-NH2为修饰目标，由于赖氨酸在蛋白质内通常数量较多，这种修饰引起蛋白质中多个赖氨酸被修饰，得到的产物是聚乙二醇化修饰异构体的混合物，目前FDA批准的已经上市的聚乙二醇化新药多数为随机修饰的产物。
PEG的修饰作用
PEG的修饰作用京江学院药物制剂0702 3071158037 赵艳华摘要：聚乙二醇修饰即PEG化，是将活化的PEG通过化学方法以共价键偶联到蛋白质或多肽分子上。
自Davis1977年首次用PEG 修饰牛血清白蛋白以来，PEG修饰技术广泛应用于多种蛋白质和多肽的化学修饰，多个PEG修饰药物上市或在临床研究中。
PEG修饰具有半衰期延长、免疫原性降低或消失、毒副作用减少以及物理、化学和生物稳定性增强等。
关键词:PEG(聚乙二醇)；修饰高分子聚乙二醇（PEG）由于其毒性小、无抗原性、具有良好的两亲性，且生物相容性已获FDA认可，对蛋白质的改造具有无可取代的优势。
聚乙二醇化修饰技术通过共价键，将聚乙二醇与被修饰药物耦联，改善药物的理化性质和生物学活性，这种技术现已广泛应用于蛋白质(肽类)、酶、抗体及小分子药物。
1 PEG化学结构及性质1.1 PEG化学结构结构式CH2（OH）-（CH2CH2O）n -CH2OH1.2 PEG性质【1】聚乙二醇系列产品通常情况下溶于水和多种有机溶剂，不溶于脂肪烃、苯、乙二醇等，不会水解变质，有广泛的溶解范围和优良的相容性、很好的稳定性、润滑性、成膜性、增塑性、分散性等。
系低毒物质，且无刺激性，属非离子型聚合物。
2 聚乙二醇修饰剂根据化学修饰剂与蛋白质之间反应性质的不同，修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等类型，对蛋白质进行氨基、巯基和羧基等侧链基团进行化学修饰。
根据被修饰化合物包括蛋白质、多肽、单克隆抗体分子片段、以及小分子化合物等的不同分子量大小、分子结构以及其理化特性，公司采取不同的聚乙二醇化技术方法对这些化合物进行修饰【2,3】。
2.1随机修饰随机修饰蛋白质多以赖氨酸的ε-NH2或α-NH2为修饰目标，由于赖氨酸在蛋白质内通常数量较多，这种修饰引起蛋白质中多个赖氨酸被修饰，得到的产物是聚乙二醇化修饰异构体的混合物，目前FDA批准的已经上市的聚乙二醇化新药多数为随机修饰的产物。
PEG衍生物及其蛋白药物修饰的PEG材料介绍
PEG衍生物及其蛋白药物修饰的PEG材料介绍药物的聚乙二醇修饰即聚乙二醇化,是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白、多肽、小分子有机药物和脂质体上是一种蛋白质工程分子修饰方法。
药物的聚乙二醇修饰可分为两个阶段。
第一阶段的修饰技术局限于应用相对分子质量低的单甲氧基聚乙二醇(<20000)。
常用的修饰剂有单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SS)、单甲氧基聚乙二醇碳酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SC)等,通过酯键或三嗪环将聚乙二醇与药物分子偶联,这种非特异性的不稳定连接方式使得一个药物分子经常连接数个聚乙二醇分子。
但第一代聚乙二醇修饰药物通常表现出不稳定性、较大的毒性和免疫原性,生物活性、药代动力学的性质与原型药物没有本质的改变。
以应用相对分子质量高(>20000)聚乙二醇修饰剂为特征的第二阶段的修饰技术具有连接稳定、定点修饰、控释等特点,修饰后的药物具有更高的生物活性、更好的物理及热稳定性、更高的产品均一性和纯度。
但总得说来,蛋白药物PEG修饰技术中最大的问题就是无法实现定点修饰,修饰产物不均一,给分离纯化带来很大难度,也很大程度上阻碍了临床应用。
根据蛋白质的氨基酸性质和PEG衍生物的特点,科研人员开发了多种定点修饰的策略和方法。
有一些蛋白的N端对其生物活性起着重要作用,如果在N端实施PEG修饰则会使蛋白的生物活性丧失,因此将PEG修饰的位点转移至C 端则是一种有效的修饰策略。
一般选用mPEG-酰肼或mPEG-胺对蛋白质进行修饰,羧基的修饰位点包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。
mPEG-酰肼是近年来开发的又一种可与羧基特异性结合的修饰剂。
与赖氨酸相比,半胱氨酸在蛋白质中出现几率和数量很少,利用具有巯基反应活性PEG衍生物就可以实现蛋白定点修饰,但缺点是半胱氨酸的巯基通常处于蛋。
白的活性中心,修饰后会使蛋白活性损失较大。
对于没有半胱氨酸的蛋白则可以通过基因工程手段引入巯基反应位点。
蛋白质、多肽修饰中的PEG化学
蛋白质、多肽修饰中的PEG化学背景PEG修饰是一个使多肽或蛋白质在治疗或生物技术方面的效力得以提高的重要过程。
当PEG以适当的方式连接在蛋白质或多肽上时，它能改变许多的特征，而主要的生物活性功能，如酶活性或特异结合位点，可以保留下来。
PEG修饰通过如下几种途径改善药物的性能。
首先，PEG连接在蛋白质或多肽的表面上，提高了它的分子大小，并且它还能携带大量的水分子，一种PEG-蛋白质因而增大了5～10倍。
其次，PEG修饰使得以前不溶的蛋白质不仅容易溶解，而且具有高度移动性。
此外，PEG修饰可以减少肾脏对药物的滤过作用，降低它的致热原性，还可以减少蛋白酶对其的消解，通过保护分子免受人体免疫系统的攻击来改善了它的输送。
同时，因为它逃避了人体防御机构，因而在作用部位停留的时间就长得多，并使局部药物浓度增高。
目前在国外上市的PEG-多肽(或PEG-蛋白质)产品有：Schering-Plough公司的PEG-Intron，于2001年1月22日由FDA批准上市。
它采用了Enzon公司开发的专利PEG技术。
这种重组干扰素α-2b与一个12,000 dalton PEG分子连接，使其抗病毒活性和消除半衰期之间达到最佳平衡。
Enzon还有两种已经被FDA通过的PEG修饰蛋白商品：ADAGEN和ONCASPAR。
ADAGEN用于缺失ADA而引起的严重联合免疫缺陷病（SCID）；ONCASPAR即PEG修饰的天冬酰胺酶（L-asparaginase），用于治疗急性淋巴细胞白血病（ALL），天冬酰胺酶需要隔天注射，而PEG修饰后可以一周注射一次，还可以减少过敏。
另外，罗氏公司生产的抗病毒性肝炎特效药派罗欣，日前获得了瑞士国际药品管理署的销售许可。
瑞士权威机构的认证是基于两个国际多中心三期临床试验的结果，该试验表明，每周注射一次派罗欣可以获得长久的持续病毒学反应，疗效比标准干扰素高出许多。
特别是对伴有肝硬化的难治性患者也有显著的效果。
合成多肽药物PEG修饰的研究进展
４８
FRIEND OF CHEMICAL INDUSTRY
生化与医药 ２００６．ＮＯ．１１ 化工之友
费托反应水中有机物分离的研究进展
王正予 张宏勋 张秋香 （华东理工大学化工学院 上海 ２００２３７）
摘 要： 费托合成是煤炭间接液化核心反应，间接液化合成的同时产生大量反应水以及含氧有机物，包括醛、酮、醇、酸等， 对这部分含氧有机物的有效分离回收，无论是对装置的经济效益，还是对环保都具有重要意义。本文探讨了Ｓａｓｏｌ－Ｉ厂和山西煤化所 反应水分离流程，对两个流程的优缺点进行了比较，并指出在我国研究开发费托反应水分离工艺的必要性及其光明前景。 关键词：费托合成 Ｆ－Ｔ 反应水 分离工艺 前景
饰是采用 Ｃ 端接上半胱氨酸，裂解纯化后，利用弱碱性条件下， ｍＰＥＧ５０００－ＭＡＬ 仅与巯基反应的特性，采用液相法对其修饰， 最后经 Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ 分离得到目标产物。
１．２ Ｎ 端的修饰 Ｌ ｕ 等［４］人以 ｍ Ｐ Ｅ Ｇ （Ｃ Ｈ ３Ｏ － Ｐ Ｅ Ｇ ）羧基衍生物 ｍ Ｐ Ｅ Ｇ － Ｏ － ＣＨ ２Ｃ Ｏ Ｏ Ｈ 和 ｍ Ｐ Ｅ Ｇ － Ｏ － Ｃ Ｈ２Ｃ Ｏ － Ｎ ｌ ｅ － Ｏ Ｈ ，在固相合成法中， 作为单体偶联到 Ｎ 端。后一个单体引入 Ｎｌｅ 是为了方便检测多肽 的 Ｐ Ｅ Ｇ 修饰程度。 王良友［７］等人对上市多肽药物人甲状旁腺素（１－３４）Ｎ 端的 Ｐ Ｅ Ｇ 修饰，固相合成肽链时接上一个半胱氨酸，裂解纯化后的 精肽在弱碱性条件下与 ｍＰＥＧ５０００－ＭＡＬ 反应得修饰产物。 １．３ 赖氨酸侧链氨基的酰化修饰 Ｌｕ 等［８］报道以 ｍＰＥＧ 羧基衍生物修饰赖氨酸侧链氨基得到 Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ （ｍＰＥＧ－ＯＣＨ２ＣＯ） －ＯＨ ， 在固相多肽合成中将其 作为一个单体偶联到肽链中去，实现聚乙二醇对肽链中特定赖氨 酸侧链氨基的聚乙二醇化修饰。为了更好的判断多肽的 ＰＥＧ 修 饰程度，引进 Ｎ ｌ ｅ ，合成出 Ｆ ｍ ｏ ｃ － Ｌ ｙ ｓ （ ｍ Ｐ Ｅ Ｇ － Ｏ Ｃ Ｈ ２Ｃ Ｏ － Ｎｌｅ） －ＯＨ 单体。他们还选用 Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ （Ａｌｌｏｃ）－ＯＨ 作为单 体接到特定位置上，肽链组装完毕后先用 Ｐｄ 催化脱除 Ａｌｌｏｃ ， 再将 ｍ Ｐ Ｅ Ｇ － Ｏ Ｃ Ｈ Ｃ Ｏ Ｏ Ｈ 偶联到赖氨酸侧链氨基上去． 然后
PEG在辅料中的应用
聚乙二醇的应用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，是由环氧乙烷与水或乙二醇逐步加成聚合而得到的一类分子量较低的水溶性聚醚，聚乙二醇由于其聚合度差异，分子量通常在200～35 000之间，其化学通式为HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH。
总的说来，在药剂学方面聚乙二醇主要可被用作为药物溶剂，药物附加剂或辅料，增塑剂和致孔剂，药物载体，修饰材料和渗透促进剂等。
聚乙二醇具有良好的生物相容性和两亲性，由此我们就可以看出聚乙二醇的在药剂学上的广泛用途。
作为一种两亲性聚合物，PEG既可溶于水，又可溶于绝大多数的有机溶剂，且具有生物相容性好、无毒、免疫原性低等特点，可通过肾排出体外，在体内不会有积累。
此外，PEG具有一定的化学惰性，但在端羟基进行活化后又易于和蛋白质等物质进行键合，键合后，PEG可将其许多优异性能赋予被修饰的物质。
作为表面修饰材料，聚乙二醇在体循环中的优点还有能防止与血液接触时血小板在材料表面的沉积，有效延长被修饰物在体内的半衰期，提高药物传递效果。
PEG获得了FDA的认可，被中、美、英等许多国家药典收载作为药用辅料。
长期以来，PEG在软(乳)膏剂、栓剂、滴丸剂、硬胶囊、滴眼剂、注射剂、片剂等各种药剂中有着广泛应用。
从上个世纪90年代开始，PEG在新型药物制剂中的应用的研究越来越多。
1 PEG修饰的纳米给药系统纳米给药系统，也称纳米控释系统，包括纳米微球(Nanospheres)和纳米胶(Nanocapsules)，它们是直径在10～500nm之间的固状胶态粒子，活性组分(药物和生物活性材料等)通过溶解、包裹作用置于纳米粒的内部，或者通过吸附、附着作用置于纳米粒表面。
纳米给药系统具有降低药物毒副作用、防止药物失活、控制药物释放速率和靶向给药的效果，从而既可提高病灶部位的药物浓度，又可减少对机体其它部位的损害，提高药物的有效利用度，因而成为较理想的药物传输体系。
目前，纳米给药系统的载体材料一般为可生物降解聚合物，如以聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚癸二酸酐(PSA)为代表的聚酯、聚酸酐、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚原酸酯等具有良好生物相容性和可生物降解性的聚合物。
聚乙二醇在生化药物化学修饰中的应用
vivo and i n vit ro exposure to alpha2asarone.M utat Res, 1992,279(4):269.19Fautz R,Forster R,Hechenberger CMA.Report of a comparative study of DNA damage and repair assays in primary rat hepatocytes chemicals with five coded chemicals.M utat Res,1991,260:281.20杨永年,李庆天,唐玲芳,等.石菖蒲主要成分α2细辛醚致畸性研究.南京医学院学报,1986,6(4):248.21Salazar M,Salazar S,Ulloa V,et al.Teratogenic action of alpha2asarone in the mousel.J Toxicol Cli n Ex p,1992,12(3):149.22Wiseman RW,Miller EC,Miller JA,et al.Structure2activity studies of the hepatocarcinogenicities of alkenylbenzene derivatives related to estragole and safrole on administration to preweanling male C57BL/6J XC3H/HeJ F1,mice.Cancer Res,1987,47(9):2275.23Lopez ML,Hernandez A,Chamorro G,et al.Alpha2asarone toxicity in long2tern cultures of adult rat hepatocytes.Planta Med,1993,59(2):115.24甘俊,黄仁彬,林军,等.复方α2细辛脑长期毒性研究.广西医学院学报,1990,7(3):38.(收稿:1996-05-23)聚乙二醇在生化药物化学修饰中的应用周文孝 袁庆辉(驻马店463000济南军区生物制品药物研究所)摘要 目的:对聚乙二醇(PEG)2生化药物化学修饰法的实用性作一考查。
蛋白多肽类药物聚乙二醇化修饰研究进展
蛋白多肽类药物聚乙二醇化修饰研究进展作者：杨旭贡济宇来源：《中国当代医药》2012年第31期[摘要] 近年来，越来越多具有生物活性的蛋白多肽类药物被发现，因其生理功能上的高效性及专一性而广泛用于治疗各种疾病。
但由于其在体内易被降解，且生物半衰期短，使其应用受到了限制。
通过化学修饰的方法，可以延长蛋白肽类药物的生物半衰期，提高药效，降低副作用。
聚乙二醇能有效增加蛋白多肽类药物在体内的稳定性，本文就聚乙二醇共价连接修饰蛋白质及多肽类药物做一综述。
[关键词] 蛋白质；多肽；聚乙二醇化；研究进展[中图分类号] R914 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）11（a）-0016-03随着基因工程、生物制药及肽类药物固相合成技术的发展，许多极具开发和应用前景的多肽蛋白类药物逐渐受到关注，且在疾病的诊断、预防及治疗中占有越来越重要的位置。
但这类药物稳定性差，在生物体内半衰期较短，所以提高其在体内的稳定性成为研究焦点。
聚乙二醇（PEG）是中性、无毒、无免疫原性、有良好的生物相容性的高分子聚合物，具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，当耦联到药物分子表面时，可改变其生物分配行为和溶解性，产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中被快速消除。
将蛋白肽类药物进行PEG修饰，可以提高药物在体内的稳定性，以改善体内半衰期，因而被广泛用于蛋白多肽药物的修饰，以改善该类药物在体内的性质。
本文对PEG的性质、修饰策略及研究现状等方面进行综述。
1 聚乙二醇的性质及选择PEG是经环氧乙烷聚合生成的一类高分子化合物。
它不仅具有良好的水溶性，也能溶于二氯甲烷、乙腈和乙醇等有机溶剂。
通过化学反应先在PEG上连接“小分子臂”，再通过连接臂与化合物相接，这一过程称为PEG的活化，活化后的PEG即为PEG修饰剂。
本文总结了近年来新兴的几种聚乙二醇修饰剂，见表1。
PEG修饰剂的选择决定了修饰后药物的性质，一个理想的PEG修饰剂至少满足以下条件：（1）无毒，无免疫原性且生化性质稳定。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
-N-羟基琥珀酰亚胺
5K
MPEG-NHS10
-N-羟基琥珀酰亚胺
10K
100 10 5
100 10 5
30000 6000 3000
35000 7000 3500
MPEG-NHS20
-N-羟基琥珀酰亚胺
20K
三、药用蛋白的PEG修饰方法
1.修饰反应器设计—PEG-pellet 反应器
创新技术（反应器技术和产物移走技术）
中国发明专利，申请号
①振荡反应器 ②流加反应器 ③缓释反应器 200510114930.0 中国发明专利，申请号 0410029577
④固相反应方式⑤ຫໍສະໝຸດ 水相反应方式⑥膜耦合反应方式
Q. Yun, R. Yang, T. Chen, J. Bi, G. Ma, Z Su. J. Biotechnology, 2005, 118: 67-74
一、PEG修饰的国内外研究进展
国际上PEG修饰技术的研究进展
美国Rutgers大学Davis教授70年代的工作
甲氧基PEG的应用 美国最早从事PEG修饰蛋白质药物的公司 各种PEG修饰剂的生产商 PEG药物：PEG-INF，PEG-G-CSF
美国Enzon公司
美国Shearwaters公司
蛋白质药物的PEG化学修饰
胡 涛
中国科学院过程工程研究所
生化工程国家重点实验室
蛋白质药物在使用中出现的问题
C
理想浓度 实际浓度
1.迅速被体内酶降解
2.肾小球过滤清除 3.抗原－抗体反应
4.溶解度差导致沉淀
T
体外聚乙二醇修饰（PEG化）
CH3(-O-CH-CH)n-OH
+
聚乙二醇
蛋白或多肽
偶联物
(1)增大药物分子量，避免被肾小球过滤 (2)阻碍蛋白酶的降解作用
我国在PEG修饰蛋白质方面的一些工作
修饰粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF） 修饰人肿瘤坏死因子 修饰白介素I受体拮抗剂（rhIL-1Ra） 修饰牛胰核糖核酸酶（RNase） 延长半衰期 消除副作用 延长半衰期 提高抗肿瘤活性
修饰超氧化物歧化酶（SOD）
修饰天冬酰氨酶（Aspartase） 修饰人干扰素（IFN） 修饰血红蛋白（Hb） 修饰胰岛素
3.PEG醛制备单修饰的药用蛋白
PEG-INF的制备过程
CH3(-O-CH-CH)n-OH 甲氧基PEG（mPEG-OH） 活化的mPEG-O-醛
G-CSF
PEG-G-CSF
粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)
MW: 18.8kd (174 amino acids) pI: 6.1,1 thiol, 1 Nterminal, 4 lysines, Half life: 5 h,Weekly injection: 7 times
PEG修饰的位点反应动力学
100
PEGylation (%)
80 60 40 20 0 0 4 8 12 16
Val-1 Lys-11 Lys-56
Incubation time (h)
PEG醛修饰药用蛋白的优化反应
Absorbance at 280 nm
0
PEGylated SAK
SAK
10 20 30 40
美国罗氏、先灵宝雅、安进
其它：辉瑞、默克、葛兰素史克、施贵宝。。。
国内PEG修饰技术的研究进展
国家863重大机密项目：人工血液代用品的研制，1997-2000 中国科学院重点项目：血液代用品和血液净化，2001-2005 国家重大科技专项课题《创新药物和中药现代化》：长效基因 工程蛋白质和多肽制剂关键技术，2002-2005 国家863重点项目课题：核酸和多肽的修饰和剂型化技术， 2007-2010 PEG修饰血红蛋白：I 期临床 （中科院过程所、凯正公司） PEG修饰G-CSF：III 期临床 （格兰百克）
2007-9-8~ 2007-9-18 2007-10-9~
生产周期10天
3
200710001
2007-10-21
PEG化重组人生长激素，批产量1-10g；
PEG化降纤酶，批产量6000支； 环孢素A眼用微乳制剂，批产量5000支
修饰和剂型化产品质量达到国际先进水平
生产规模
以分子量为30kDa的PEG修饰rhG-CSF为例：
三批PEG30-rhG-CSF产品的制备
PEG化G-CSF
序号 产品批号 试制日期 试制量
取 得 的 主 要 进 展
2L修饰反应器
1
200708001
2007-8-5~
计算机程序控制 批产量>3g
2 200709001
2007-8-15
共3750 mg： 6 mg/支，302支； 3 mg/支，210支； 1.5 mg/支，520支； 6.6 mg/ml，80 ml 共1263 mg： 3 mg/支，400支； 3.15 mg/ml，20 ml 共1422 mg： 3 mg/支，400支； 3.4 mg/ml，65 ml。
该PEG修饰产物的凝胶过滤分析
Absorbance at 280 nm
0
Lyz
PEG-Lyz
10 20 30 40
Time (min)
四、PEG修饰工艺的优化
PEG修饰反应参数的优化
建立反应动力学，包括位点反应动力学和蛋白分 子反应动力学，优化反应时间 优化反应的pH值
优化PEG与蛋白的摩尔比
O CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-NH——G-CSF
以PEG-OH为原料的必然途径
Roche公司的长效干扰素产品专利分析
双链修饰：
同样是以PEG-OH为原 料的必然途径
新的修饰策略
采用新方法制备新的修饰剂
单链修饰：
CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2OH O CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-O-N O O CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH (CM-PEG) + NH2——G-CSF
+
NH2——IFN
以PEG-COOH为原料的必然途径
1、PEG修饰剂的批量制备取得了成功
mPEG-CH2CH2OH + NaClO TEMPO/KBr ice bath, H2O lys-OEt 2HCl mPEG-CH2COOH
取 得 的 主 要 进 展
分枝型 ZL 01141745.5
mPEG-CH2CONH mPEG-CH2CONH-CH2CH2CH2CH2
-10
180
190
200
210
220
230
240
250
260
Elution Volume, ml
Wavelength (nm)
(B)
(C)
4. 引入巯基的方法制备PEG修饰蛋白
NH2-Hb
(1) Thiolation + NH S 2-iminothiolane + NH HS-(CH2)3-C-NH-Hb O (2) PEGylation PEG N O O PEG N O + NH -S-(CH2)3-C-NH-Hb
(3)屏蔽药物的免疫位点
(4)增加药物在体液中的溶解度
(5)与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物
生化工程
（生物化学工程，Biochemical Engineering）
反应工程 分离工程 剂型工程
生物医药 生物能源 生物材料 生物化学品
其它产品
目 录
PEG修饰的国内外研究进展 PEG修饰剂的研发 PEG修饰方法 PEG修饰工艺的优化 PEG修饰产物的质量控制
提高半衰期
克服免疫原性 提高半衰期 提高半衰期 血液代用品 提高半衰期
二、PEG修饰剂的研发
Sc-PEG 专利分析
单链修饰：
CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nOH + 光气 + NHS O O + O NH2——G-CSF
CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-O-N (SC-PEG)
2.固相吸附法制备PEG修饰蛋白
吸附蛋白 加入PEG PEG修饰 洗脱
固相吸附法与液相吸附法的比较
1
Absorbance at 280 nm
SAK
3 2 1
Liquid PEG-SAK
1 2
Solid PEG-SAK
2
PEG-SAK
0
10
20
30
40
Time (min)
1峰：原蛋白；2峰：单修饰蛋白； 3峰：多修饰蛋白
0.1M NaOH COOC2H5
mPEG-CH2CONH
COOH
mPEG-CH2CONH-CH2CH2CH2CH2
TEMPO/KBr ice bath, H2O DCC,NHS mPEG-CH2COOH
分叉(长尾)型 ZL 03100736.8
mPEG-CH2CH2OH + NaClO O mPEG-CH2COO-N
P1
P2
20 15
UV280 (mAU)
10 5 0 0 5 10 15 20
优化反应体系
蛋白分子的修饰反应动力学
p Time p p p p p
…………
Weijun Li, Zhiguo Su. Quantitatively investigating monomethoxypolyethylene glycol modification of protein by capillary electrophoresis, J. Biochem. Biophys. Methods. 2004，59: 65-74