蛋白质药物PEG化学修饰指南

2007-9-8~ 2007-9-18 2007-10-9~
生产周期10天
3
200710001
2007-10-21
PEG化重组人生长激素，批产量1-10g；
PEG化降纤酶，批产量6000支； 环孢素A眼用微乳制剂，批产量5000支
修饰和剂型化产品质量达到国际先进水平
生产规模
以分子量为30kDa的PEG修饰rhG-CSF为例：
+
NH2——IFN
以PEG-COOH为原料的必然途径
1、PEG修饰剂的批量制备取得了成功
mPEG-CH2CH2OH + NaClO TEMPO/KBr ice bath, H2O lys-OEt 2HCl mPEG-CH2COOH
取 得 的 主 要 进 展
分枝型 ZL 01141745.5

mPEG-CH2CONH mPEG-CH2CONH-CH2CH2CH2CH2
Sangart公司是一家私营的生物制药公司，主 要从事氧载体的研发和产业化
Hemospan -- MP4
Phase I – Sweden Phase Ib/II – Sweden Phase II – Sweden Phase II – USA Phase III – Europe Status: Status: Status: Status: Status: Complete Complete Complete Enrollment Complete Enrollment Complete
一、PEG修饰的国内外研究进展
国际上PEG修饰技术的研究进展

美国Rutgers大学Davis教授70年代的工作

甲氧基PEG的应用 美国最早从事PEG修饰蛋白质药物的公司 各种PEG修饰剂的生产商 PEG药物：PEG-INF，PEG-G-CSF

美国Enzon公司


美国Shearwaters公司
提高半衰期
克服免疫原性 提高半衰期 提高半衰期 血液代用品 提高半衰期
二、PEG修饰剂的研发
Sc-PEG 专利分析
单链修饰：
CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nOH + 光气 + NHS O O + O NH2——G-CSF
CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-O-N (SC-PEG)
O
CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH——G-CSF
以PEG-COOH（CM-PEG)为原料的必然途径，已获专利
我们的策略
双链修饰：
CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH + Lysine O CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH CH2 O O (CH2)3 CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH- CH-C-O-N O O O CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH CH2 O (CH2)3 ——IFN CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH- CH-C-NH O
Time (min)
单修饰产物的分离纯化
50 140 40
100
UV280(mAU)
80 60 40 20 0
30
20
10
0 0 10 20 30 40 50 60
Volume(mL)
Conductivity(ms/cm)
120
P1
P2
分离产物分析
KDa
200 116 66.4 44.3 29.0 20.1
-N-羟基琥珀酰亚胺
5K
MPEG-NHS10
-N-羟基琥珀酰亚胺
10K
100 10 5
100 10 5
30000 6000 3000
35000 7000 3500
MPEG-NHS20
-N-羟基琥珀酰亚胺
20K
三、药用蛋白的PEG修饰方法
1.修饰反应器设计—PEG-pellet 反应器
创新技术（反应器技术和产物移走技术）


美国罗氏、先灵宝雅、安进


其它：辉瑞、默克、葛兰素史克、施贵宝。。。
国内PEG修饰技术的研究进展




国家863重大机密项目：人工血液代用品的研制，1997-2000 中国科学院重点项目：血液代用品和血液净化，2001-2005 国家重大科技专项课题《创新药物和中药现代化》：长效基因 工程蛋白质和多肽制剂关键技术，2002-2005 国家863重点项目课题：核酸和多肽的修饰和剂型化技术， 2007-2010 PEG修饰血红蛋白：I 期临床 （中科院过程所、凯正公司） PEG修饰G-CSF：III 期临床 （格兰百克）
(3)屏蔽药物的免疫位点
(4)增加药物在体液中的溶解度
(5)与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物
生化工程
（生物化学工程，Biochemical Engineering）
反应工程 分离工程 剂型工程
生物医药 生物能源 生物材料 生物化学品
其它产品
目 录
PEG修饰的国内外研究进展 PEG修饰剂的研发 PEG修饰方法 PEG修饰工艺的优化 PEG修饰产物的质量控制
三批PEG30-rhG-CSF产品的制备
PEG化G-CSF
序号 产品批号 试制日期 试制量
取 得 的 主 要 进 展
2L修饰反应器
1
200708001
2007-8-5~
计算机程序控制 批产量>3g
2 200709001
2007-8-15
共3750 mg： 6 mg/支，302支； 3 mg/支，210支； 1.5 mg/支，520支； 6.6 mg/ml，80 ml 共1263 mg： 3 mg/支，400支； 3.15 mg/ml，20 ml 共1422 mg： 3 mg/支，400支； 3.4 mg/ml，65 ml。
O CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-NH——G-CSF
以PEG-OH为原料的必然途径
Roche公司的长效干扰素产品专利分析
双链修饰：
同样是以PEG-OH为原 料的必然途径
新的修饰策略
采用新方法制备新的修饰剂
单链修饰：
CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2OH O CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-O-N O O CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH (CM-PEG) + NH2——G-CSF
Glu(OEt)2HCl TEA
CH2CH2COOEt mPEG-CH2CONH-CH COOEt
可逆型 ZL03105003.4

O
O O mPEG-OH + Cl3C O C O Cl3 + HO N O
N mPEG
O O C O
O N O + N· HCl
不可逆型 200410029577.1 ZL02120740.2
-10
180
190
200
210
220
230
240
250
260
Elution Volume, ml
Wavelength (nm)
(B)
(C)
4. 引入巯基的方法制备PEG修饰蛋白
NH2-Hb
(1) Thiolation + NH S 2-iminothiolane + NH HS-(CH2)3-C-NH-Hb O (2) PEGylation PEG N O O PEG N O + NH -S-(CH2)3-C-NH-Hb
PEG修饰的位点反应动力学
100
PEGylation (%)
80 60 40 20 0 0 4 8 12 16
Val-1 Lys-11 Lys-56
Incubation time (h)
PEG醛修饰药用蛋白的优化反应
Absorbance at 280 nm
0
PEGylated SAK
SAK
10 20 30 40
该PEG修饰产物的凝胶过滤分析
Absorbance at 280 nm
0
Lyz
PEG-Lyz
10 20 30 40
Time (min)
四、PEG修饰工艺的优化
PEG修饰反应参数的优化
建立反应动力学，包括位点反应动力学和蛋白分 子反应动力学，优化反应时间 优化反应的pH值
优化PEG与蛋白的摩尔比
蛋白质药物的PEG化学修饰
胡 涛
中国科学院过程工程研究所
生化工程国家重点实验室
蛋白质药物在使用中出现的问题
C
理想浓度 实际浓度
1.迅速被体Leabharlann Baidu酶降解
2.肾小球过滤清除 3.抗原－抗体反应
4.溶解度差导致沉淀
T
体外聚乙二醇修饰（PEG化）
CH3(-O-CH-CH)n-OH
+
聚乙二醇
蛋白或多肽
偶联物
(1)增大药物分子量，避免被肾小球过滤 (2)阻碍蛋白酶的降解作用
P1
P2
20 15
UV280 (mAU)
10 5 0 0 5 10 15 20
3.PEG醛制备单修饰的药用蛋白
PEG-INF的制备过程
CH3(-O-CH-CH)n-OH 甲氧基PEG（mPEG-OH） 活化的mPEG-O-醛
G-CSF
PEG-G-CSF
粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)
MW: 18.8kd (174 amino acids) pI: 6.1,1 thiol, 1 Nterminal, 4 lysines, Half life: 5 h,Weekly injection: 7 times
2.固相吸附法制备PEG修饰蛋白
吸附蛋白 加入PEG PEG修饰 洗脱
固相吸附法与液相吸附法的比较
1
Absorbance at 280 nm
SAK
3 2 1
Liquid PEG-SAK
1 2
Solid PEG-SAK
2
PEG-SAK
0
10
20
30
40
Time (min)
1峰：原蛋白；2峰：单修饰蛋白； 3峰：多修饰蛋白
(A)三批产品的SDS-PAGE检测图谱
(B)三批产品的高效凝胶过滤检测图谱 (C)三批产品的园二色检测图谱
3
20
产品质量
批次稳定性
2 1 2 3
1
80 60 40
Adsorbance at 280nm
15
1 2 3
10
Intensity
20 0 -20
(A)
5
0
-40
-5 0 5 10 15 20 25
中国发明专利，申请号
①振荡反应器 ②流加反应器 ③缓释反应器 200510114930.0 中国发明专利，申请号 0410029577
④固相反应方式
⑤双水相反应方式
⑥膜耦合反应方式
Q. Yun, R. Yang, T. Chen, J. Bi, G. Ma, Z Su. J. Biotechnology, 2005, 118: 67-74
我国在PEG修饰蛋白质方面的一些工作
修饰粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF） 修饰人肿瘤坏死因子 修饰白介素I受体拮抗剂（rhIL-1Ra） 修饰牛胰核糖核酸酶（RNase） 延长半衰期 消除副作用 延长半衰期 提高抗肿瘤活性
修饰超氧化物歧化酶（SOD）
修饰天冬酰氨酶（Aspartase） 修饰人干扰素（IFN） 修饰血红蛋白（Hb） 修饰胰岛素
0.1M NaOH COOC2H5
mPEG-CH2CONH
COOH
mPEG-CH2CONH-CH2CH2CH2CH2
TEMPO/KBr ice bath, H2O DCC,NHS mPEG-CH2COOH
分叉(长尾)型 ZL 03100736.8

mPEG-CH2CH2OH + NaClO O mPEG-CH2COO-N
优化反应体系
蛋白分子的修饰反应动力学
p Time p p p p p
…………
Weijun Li, Zhiguo Su. Quantitatively investigating monomethoxypolyethylene glycol modification of protein by capillary electrophoresis, J. Biochem. Biophys. Methods. 2004，59: 65-74

O
O O base dioxane,reflux
O O acid 50oC
mPEG-OH + Cl
mPEG O
mPEG
O
异端基双官能团 200410029577.1

COOH NH NaOH
COONa EO NH
COOH H
+
N
CH2CH2O m H
聚乙二醇修饰剂产品
产品号 mPEG-OH5 mPEG-OH10 mPEG-OH20 mPEG-COOH5 mPEGCOOH10 mPEGCOOH20 MPEG-NHS5 末端基团 -OH -OH -OH -COOH -COOH -COOH 分子量 5K 10K 20K 5K 10K 20K 包装（g） 100 10 100 10 100 10 100 10 100 10 100 10 100 10 5 价格（￥） 3500 700 7000 1400 7000 1400 10000 2000 15000 3000 20000 4000 20000 4000 2000