扫描电镜 样品制备方法

扫描电镜样品制备方法

一、取材

组织块小于3立方毫米（单细胞培养或收集展片于盖玻片或滤膜上）。

二、固定

前固定：2.5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）固定2小时或更长时间。

用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。

三、脱水

＊脱水在4度冰箱内进行，所有脱水步骤建议在专用的冷冻干燥杯中进行，冷冻干燥杯请于实验前一天到电镜室领取。

＊整个过程，样品不要暴露于空气。

1.乙醇脱水，每一级10-20分钟：

30%乙醇—50%乙醇—70%乙醇—90%乙醇—95%乙醇—100%乙醇；

2.然后从乙醇逐步过渡到叔丁醇，纯叔丁醇每次10分钟，3次以上；

此系列操作均在25度环境中进行；

3.纯叔丁醇4度冰箱过夜，样品结晶。

四、冷冻干燥

＊需事先预约冷冻干燥时间；

第二天上午八点半讲冷冻结冰的样品用冰盒送至电镜室进行冷冻干燥。

五、喷金

附件1：

细菌类样品的前处理方法

1.盖玻片泡酸，清洗，烘干。用剪刀剪碎，挑出5mm*5mm大小玻片备用。玻

片过大或者过厚影响观察效果。

2.菌液或样品悬液离心，需要可进行清洗，加入固定液，吹散固定，于4度冰

箱固定2小时左右。

3.固定结束后，去固定液，加入PBS浸泡清洗，10分钟。离心去PBS，固体沉

淀根据量多少，加入适量PBS，制成浓度较高的悬液（目测较混浊）。样品浓度对后期吸附有较大影响，浓度过低可能吸附量会很少。

4.取鸡蛋清，稀释3-5倍（一定要稀释！蛋清过浓会包裹样品），之前准备好的

玻片放入液体内蘸一下，取出晾干至触摸感觉有点黏的状态（快干的状态）。

将第3步取得的悬液滴在玻片上，吸附30秒到1分钟，用滤纸吸去多余液体。

（样品悬液在玻片上停留时间过长将导致样品被蛋清完全包裹而无法观察）。

5.在玻片上滴加固定液，固定10分钟，固定后用PBS浸泡清洗10分钟，放入

干燥杯开始进行脱水。

磷酸盐缓冲液(PBS)

a.磷酸盐缓冲液（0.2M）

甲液：0.2M的磷酸氢二钠溶液乙液：0.2M的磷酸二氢钠溶液

Na2HPO42H2O 35.61g (Na2HPO47H2O) 53.65g (Na2HPO412H2O) 71.64g NaH2PO4H2O 27.60g ( NaH2PO42H2O) 31.21g

加蒸馏水溶解成1000ml 加蒸馏水溶解成1000ml

按下表混合甲、乙两液既得所需pH的0.2M缓冲液

0.2M磷酸盐缓冲液的配制

将溶液用蒸馏水1：1稀释，则配得0.1M的缓冲液。0.1M的PBS为最终使用的工作浓度。