组织捣碎及细胞破碎.pptx

酶自溶法
（2）酶自溶法
常采用加热法或干燥法 比如谷氨酸产生菌，加入0.028mol/L Na2CO3和 0.018mol/L NaHCO3配成pH10.0的缓冲液，使成3%的悬浮 液加热至70℃，保温搅拌20min，菌体即自溶。又如： 酵母自溶需在45～50℃下保温12～24h。
化学试剂法
（3）化学试剂破碎法 ➢表面活性物质 ➢EDTA螯合剂 ➢有机溶剂 ➢变性剂
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外加酶法
注意事项 需要选择适宜的酶、酶系统和特定的反应条件；
在选择酶系统时，须根据细胞的结构和化学组成来选 择； 常结合其他方法预先处理；
外加酶法
外加酶法的特点
优点：选择性释放产物；条件温和；核酸泄出量 少；细胞外形完整。
不足 溶酶价格高 通用性差 产物抑制的存在；如甘露糖对蛋白酶有抑制作用， 葡聚糖抑制葡聚糖酶。
• 构件：微珠、冷却装置、搅拌浆、液珠分离器、 物料进出口。见图
高速珠磨机
工作原理：剪切，碰撞
（2）珠磨法
➢ 影响因素珠磨效率的因素 ✓ 珠体的大小：实验室规模，珠径为0.2mm较好， 工业规模，不得＜0.4mm ✓ 珠体在磨室中的装量：控制在80%～90%； ✓ 搅拌速度： ✓ 操作温度：操作温度在5～40℃范围内 ✓ 被处理细胞的特性：
（3）超声波破碎法
➢ 工作原理
空穴现象引起工作液局部区域压力差 ，从而产生一 个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在 介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液 体发生流动，从而使细胞破碎。
➢ 影响因素
✓ 仪器的功率 ✓ 介质的离子强度 ✓ pH值 ✓ 菌体的种类和浓度
电声超声波发生器
五、选择破碎方法的依据
• 1．处理量的大小； • 2．细胞壁的强度和结构； • 3．目标产物对破碎条件的敏感性； • 4．破碎后固液分离的难易程度； • 5.选择性地释放目标产物。
选择性地释放目标产物
➢ 仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围 ✓ 细胞膜附近，采用温和的破碎方法如酶溶法、渗透压冲击法、 冻融法； ✓ 细胞质内，机械破碎 ➢ 选择性溶解目标产物
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（4）渗透压冲击法
细胞 高渗溶液 脱水 低渗溶液 吸水破裂
反复冻融法 干燥法 X-press法（冻结-撞击法）
2.化学法
（1）酶法 原理： 外加酶法 ✓ 细菌类：溶菌酶 ， G+需配合EDTA ✓ 放线菌：溶菌酶
外加酶法
✓ 酵母和真菌：蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等 ✓ 植物细胞壁：纤维素酶，果胶酶；
当目标产物与膜或壁结合时，调整溶液pH值、离子强度、添 加与目标产物具有亲和性的试剂如螯合剂、表面活性剂等，使目 标产物容易释放出来
六、细胞破碎效果的检查
1.直接测定法 检测破碎前后的完整细胞数量 2.目的产物测定法 细胞破碎后，通过测定破碎液中目的产物的 释放量来估算破碎率。 3.测定导电率
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。2020年9月26日星期六下午10时38分40秒22:38:4020.9.26
1.2.2 组织捣碎及细胞破碎
（一）细胞壁的结构和特点 （二）细胞破碎机理 （三）细胞破碎方法
（一）细胞壁的结构和特点
1.植物细胞 2.微生物细胞
G+细菌和G－ 酵母细胞 真菌菌丝细胞壁
教育技术中心
革兰氏阳性细菌与阴性细菌的细胞壁成分(占细胞壁干重的%)
成分
G+
G-
肽聚糖 磷壁酸 类脂质 蛋白质
含量很高（30～95） 含量较高（<50） 一般无（<2）
0
含量很低（5～20）
0 含量较高（020）
含量较高
革兰氏阳性细菌的和革兰氏阴性细菌细胞壁构造
（二）细胞破碎的机理
• 压缩力和剪切力 • 改变细胞壁或细胞膜的结构，增大目标产物的溶出率 • 完全溶解细胞的保护屏障－细胞壁
（三 ）细胞破碎的方法
（1）高压匀浆法
➢ 注意： ✓ 易造成堵塞的团状或丝状真菌； ✓ 较小的革兰氏阳性菌； ✓ 含有包含体的基因工程菌 。
（2）珠磨法 珠磨机
工作筒
搅拌器
• 原理：在膜腔中装入小玻璃球或小钢球，在搅 拌浆的作用下，它将使细胞悬浮液与细胞悬浮 液，细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝 一起发生碰撞、剪切，使细胞在某种程度上破 碎，再由液珠分离器分开、排出。（这些装置 的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高， 通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。）
1.物理破碎
（1）高压匀浆器
（1）高压匀浆法
➢工作原理：剪切，碰撞 ➢影响高压匀浆器破碎效果的因素 ✓压力：通常采用的压力为55～70Mpa ✓温度： ✓通过匀浆器的次数：1～2 ✓ 阀与阀座间距
高压匀浆器原理利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由 于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂,从低压环境 释放出来。