实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用

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RT-PCR技术的数据分析
•绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究
•相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
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RT-PCR技术的数据分析
• 动物疾病检测：禽流感、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸 膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等。
• 食品安全：食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业 阪崎肠杆菌等检测。
• 科学研究：医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。
• 应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、检验检疫 局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
通普
PCR
PCR
电泳
在PCR结束后对 终点产物 进行定量分析
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实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
克服了普通PCR：1、终点定量重复性不好 2、EB有毒，荧光太贵等缺点
2、用试验样本的ΔCT值减校准样本的ΔCT 值：
ΔΔCT= ΔCT（test/control) - ΔCT（calibrator)
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3、计算表达水平比率：
RT-PCR技术的数据分析
SYBR Green 熔解曲线分析
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RT-PCR技术的应用
• 临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感等传染病诊断 和疗效评价；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断； 遗传基因检测实现遗传病诊断。
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RT-PCR技术的原理及试验流程
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RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系
模板
4.5μl
Tag mixture
5.0μl
F(F’)
0.25μl
R(R’)
0.25μl
荧光染料 SYBR Green I
荧光标记的探针TaqMan探针法
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RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）
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RT-PCR技术的数据分析
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RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近 100％且偏差在 5％以内
1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
变性
退火
延伸
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RT-PCR技术的原理及试验流程
SYBR Green法优缺点
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RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法）
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RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan法
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RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan探针法优缺点
PCR扩增循环数
2. Ct 值的定义
在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —
— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的
循环数（如图所示）。
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RT-PCR技术的数据分析如何定量？-ΔΔCt
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
实时荧光定量PCR技术 的原理及应用
（Real Time Quantitative PCR）
2013-11-26
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实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义
二、RT-PCR技术的原理及试验流程
三、RT-PCR技术的数据分析
四、RT-PCR技术的应用
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实时荧光定量PCR的定义
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
PCR扩增循环数
1. 荧光域值（threshold）的设定
在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才能够
被检测到，一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底
信号。
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RT-PCR技术的数据分析如何定量？-ΔΔCt
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
PCR扩增循环数
3. Ct值与起始模板的关系
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存
在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝
数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对
数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从
1标9 准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
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实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
？为什么选择对初始模板定量 而不是终产物定量
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RT-PCR技术的原理及试验流程
相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小
内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数 量
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RT-PCR技术的数据分析
PCR分四个阶段
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RT-PCR技术的数据分析如何定量？-ΔΔCt
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RT-PCR技术的数据分析
3. Ct值与起始模板的关系
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存
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在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝
数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对
数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从
2标0 准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
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