人教版高中生物选修1 精品导学案专题5 课题3 血红蛋白的提取和分离

专题5 DNA 和蛋白质技术 课题3 血红蛋白的提取和分

离

【学习目标】本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体

系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的

基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。

【重点难点】

重点：凝胶色谱法的原理和方法。

难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

【预习案】

任务一. 凝胶色谱法（分配色谱法）：

1、概念：根据被分离蛋白质的 ，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，

来分离蛋白质的有效方法。

2、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对 的蛋白

质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速

度 ，而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路

程 ，移动速度 ，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分

离。

3、具体过程：

A. 的蛋白质由于 作用进入凝胶颗粒内部而被滞留； 的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。

颗

（2） （4） A

B.（1）混合物上柱；

（2）洗脱开始，的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；

的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；

（3）的蛋白质被滞留；的蛋白质被向下移动。

（4）不同的蛋白质分子完全分开；

（5）的蛋白质行程较短，已从中洗脱出来，的蛋白质还在行进中。

任务二．缓冲溶液：

1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明

显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。

2、作用：能够抵制的对溶液的的影响，

维持PH基本不变。

3、缓冲溶液的配制

通常由种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的就可以制得使用的缓冲液。

任务三. 电泳：

1、概念：指发生迁移的过程。

2、原理：许多重要的生物大分子，如等都具有

在下，这些基团会带上。在电场

的作用下，这些带电分子会向着与其

移动。电泳利用了待分离样品中各种分子以及分子本身、的不同使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。

3、分类：

①电泳

②电泳。

测定（蛋白质相对分子质量）通常用十二烷基硫酸

钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静

带电性质、分子大小和形

电荷的多少以及分子的大小等因素。

为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于。

任务四．实验操作

蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定

1.样品处理

(1)红细胞的洗涤

①目的：去除

②方法：离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一

同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层的红细胞液体倒入

再加入用的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤

⑤低速离心（低速短时间）

⑥重复4、5步骤次，直至上清液中已没有，表明洗涤干净。利于后续

血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。

(2)血红蛋白的释放

加到体积，再加40％体积的溶解细胞膜），置于上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白.

(3) 分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，

试管中的溶液分为4层:

第1层（最上层）：甲苯层

第2层（中上层）：的沉淀层，色薄层固体

第3层（中下层）：的水溶液层，的液体

第4层（最下层）：其它杂质的沉淀层

(4)透析

2.凝胶色谱制作

1）凝胶色谱柱的制作

①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。

②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。

a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；

b、在橡皮塞顶部切出锅底状的，在0.5ml的头部切下长

的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。

c.剪尼龙网小圆片覆盖在上，用的尼龙纱将橡皮塞包好，

插到玻璃管一端。

d、色谱柱下端用移液头部做，连接一细的，并用螺旋夹控制尼龙管

的，另一端放入收集的收集器内

③顶塞的制作：

插入安装了玻璃管的橡皮塞

④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。

⑤安装其他附属结构。

2）凝胶色谱柱填料的处理

（1）凝胶的选择：。

（2）方法：

配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于中充分溶胀后，配成。

（3）凝胶色谱柱的装填方法

①固定：将色谱柱处置固定在支架上

②装填：将一次性的缓慢倒入内，装填时轻轻

敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。

③洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在高的操作压下，用300ml的

20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分12小时。

3）样品加入与洗脱

（1）加样前：打开下端出口，使柱内凝胶面上的缓慢下降到与平齐，关闭出口

（2）加透析样品

①调整缓冲液面：与凝胶面平齐