苯甲酰胺类化合物的应用及其药物的生产技术

本技术公开了一种苯甲酰胺类化合物的新用途。

具体而言，本技术中的4(3,5二甲氧基苯甲酰)N(4羟基5异丙基2甲基苯基)苯酰胺具备AKR1B10抑制剂的功能，同时对AKR1B1具有较好的抑制活性，可以用于制备与AKR1B10相关的抗癌药物。

权利要求书
1.一种苯甲酰胺类化合物的应用，其特征在于，所述苯甲酰胺类化合物为4-(3,5-二甲氧基苯甲酰)-N-(4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)苯酰胺，该化合物或其可药用盐在制备用于预防和/或治疗与AKR1B10和AKR1B1中的一种或两种相关的肿瘤细胞的增殖和抗凋亡过程中的癌症疾病的药物中的应用，其中4-(3,5-二甲氧基苯甲酰)-N-(4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)苯酰胺的结构式如下：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述可药用盐为4-(3,5-二甲氧基苯甲酰)-N-(4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)苯酰胺与无机酸和有机酸中的一种或两种以上形成的药学上可接受的盐，该盐为酸加成盐。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述无机酸包括盐酸、磷酸和硫酸。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述有机酸包括醋酸、马来酸、枸橼酸、苯磺
酸、甲基苯磺酸、富马酸和酒石酸。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述与AKR1B10和AKR1B1中的一种或两种相关的肿瘤细胞包括鳞状细胞肺癌、胰腺癌、早期肝癌、子宫癌、胆管癌、胰腺癌、胃癌和食管癌。

6.一种预防和/或治疗AKR1B10和AKR1B1中的一种或两种相关的癌症的药物，其特征在于，该药物的有效成分为权利要求1或2中所述4-(3,5-二甲氧基苯甲酰)-N-(4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)苯酰胺或其药学上可接受的盐的一种或两种以上。

技术说明书
一种苯甲酰胺类化合物的应用及其药物
技术领域
本技术属于医药技术领域，涉及一种小分子化合物的医药应用，具体涉及4-(3,5-二甲氧基苯甲酰)-N-(4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)苯酰胺或其可药用盐在制备用于治疗与AKR1B10相关的癌症疾病的药物，特别是AKR1B10抑制剂中的用途。

背景技术
AKR1B10属于醛酮还原酶超家族(Aldo-keto Reductase，AKR)的成员，AKR是烟酰胺嘌呤二核苷酸NAD(P)(H)依赖的氧化还原酶，主要催化醛或者酮的羰基还原成一级或者二级醇，是体内一级代谢酶。

研究发现，AKR1B10在多种肿瘤组织和细胞中异常表达：在84％的鳞状细胞肺癌(squamous cell pulmonary carcinomas)，70％的胰腺癌(pancreaticadenocarcinomas)及54％的有潜在肝硬化和病毒性肝炎的早期肝癌中过表达；另外，在子宫癌、胆管癌、胰腺
癌、早期胃癌和食管癌肿瘤组织中，AKR1B10的表达水平上调。

实验表明，AKR1B10表达上调可能会促进肿瘤的发生和发展。

从220例乳腺癌患者的25年完整临床病理研究中观察到：AKR1B10的表达水平与肿瘤组织大小、淋巴结转移程度是正相关的，而与患者生存期呈现负相关。

siRNA介导的AKR1B10基因沉默可抑制肝癌HCC细胞、大肠癌、肺癌和乳腺癌BT-20细胞的生长，并可抑制乳腺癌雌裸鼠和肝癌移植小鼠的肿瘤生长。

AKR1B10可以催化多种醛酮类化合物，包括芳香醛(aromatic aldehydes)，甲基乙二醛(methylglyoxal)，4-羟基壬烯醛(4-Hydroxynonenal)，反式-2-己醛(trans-2-hexanal)等化合物。

这些羰基类化合物具有高度亲电性，可以与蛋白质、DNA等生物大分子结合，形成非特异性共价修饰耦合物，引起蛋白质功能紊乱和DNA损伤，导致病理反应。

由于AKR1B10在肿瘤组织中异常表达、促进肿瘤发生和发展，同时又具有被分泌到细胞外的特异性分泌机制，被认为是潜在的抗癌靶标和癌症诊断标记物，因此积极寻找和设计新的AKR1B10抑制剂的肿瘤药物具有重要的理论意义和实际价值。

目前，从天然产物中发现的AKR1B10抑制剂如多酚类、五环三萜类和倒捻子素类化合物，以及内源性甾体激素类，胆汁酸及其代谢产物等对AKR1B10有较强的抑制能力。

甲酸类非甾体抗炎药对AKR1B10有一定的抑制能力和明显的AKR1B1选择性。

基于AKR1B10/tolrestat结构的虚拟筛选方法得到的色烯-3-甲酰胺类化合物和2-苯基亚氨基苯并吡喃类是已知活性最高的AKR1B10抑制剂(最小IC50值为6nM)，但对AKR1B1也有高度抑制活性。

技术内容
针对上述情况，本技术提供了一种小分子化合物——4-(3,5-二甲氧基苯甲酰)-N-(4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)苯酰胺或其可药用盐在制备用于治疗与AKR1B10相关的癌症疾病的药物中的用途，其中所述4-(3,5-二甲氧基苯甲酰)-N-(4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)苯酰胺的结构式如下：
优选的，在上述技术方案中，所述可药用盐包括(但不限于)4-(3,5-二甲氧基苯甲酰)-N-(4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)苯酰胺与盐酸、磷酸、硫酸等无机酸形成的酸加成盐以及与醋酸、马来酸、枸橼酸、苯磺酸、甲基苯磺酸、富马酸、酒石酸等有机酸形成的酸加成盐。

优选的，在上述技术方案中，所述与AKR1B10相关的癌症疾病包括(但不限于)鳞状细胞肺癌、胰腺癌、早期肝癌。

优选的，在上述技术方案中，所述用于治疗与AKR1B10相关的癌症疾病的药物为AKR1B10抑制剂。

所述预防和/或治疗癌症的药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

所述4-(3,5-二甲氧基苯甲酰)-N-(4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)苯酰胺化合物及其类似物或它们药学上可接受的盐为活性成分的抗肿瘤药物，需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。

所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

所述4-(3,5-二甲氧基苯甲酰)-N-(4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)苯酰胺化合物及其类似物或它们药学上可接受的盐制备的预防和/或治疗肿瘤药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。

上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

有益效果：本技术对上述小分子化合物进行了生物学活性测定，发现其对AKR1B10具有明显的抑制活性，IC50值达到了6.148μM，此外该分组对AKR醛酮还原酶家族中的另一位成员AKR1B1具有较明显的抑制活性，IC50值达到了21.12μM。

本技术中的小分子化合物4-(3,5-二甲氧基苯甲酰)-N-(4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)苯酰胺具备AKR1B10抑制剂的功能，对与AKR1B10相关的癌症疾病具有明显的抑制作用，可以用于制备与AKR1B10或AKR1B1相关的抗肿瘤药物。

所述用于预防和/或治疗与AKR1B10或AKR1B1中的一种或两种相关的癌症的药物为
AKR1B10或AKR1B1中的一种或两种抑制剂。

AKR1B10与AKR1B1具有高度的序列相似性，所述4-(3,5-二甲氧基苯甲酰)-N-(4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)苯酰胺化合物及其类似物或它们药学上可接受的盐对AKR1B10具有较强抑制活性，而对AKR1B1具有较弱抑制活性，在化合物实际应用时，副作用较低，在抑制
AKR1B10的同时对抑制AKR1B1的抑制效果较小,上述化合物具有较好的选择性和AKR1B10特异性。

附图说明
图1为实施例1中化合物对AKR1B10的酶抑制活性曲线。

图2为实施例2中化合物对AKR1B1的酶抑制活性曲线。

图3为实施例3中化合物对肝癌HCC细胞存活率抑制活性曲线。

具体实施方式
下面将结合附图及具体实施例对本技术做出进一步的描述。

实施例1：化合物4-(3,5-二甲氧基苯甲酰)-N-(4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)苯酰胺对AKR1B10的酶抑制活性实验。

实验原理：根据辅酶NADPH随着AKR1B10催化醛酮类底物还原反应的进行转化为NADP+这一特点设计。

由于NADPH在340nm处有特征最大紫外吸收峰值，而产物NADP+在此波长处吸收很弱，故可通过检测340nm的紫外吸收值降低来检测辅酶NADPH的消减程度，从而获得酶催化反应的速度。

在反应初始阶段，340nm处紫外吸收变化曲线理论应为直线(零级反应)，斜率与反应速度成正比。

当加入化合物后，反应速度降低，证明化合物对AKR1B10的催化有抑制作用。

实验试剂的准备：吡啶-3-醛、NADPH、NADP+购自Sigma-Aldrich公司。

实验步骤：
1)配置反应液
用PBS-buffer(0.1M potassium phosphate,pH 7.4)配制浓度0.15mM的NADPH反应液；
2)确定酶AKR1B10稀释比例
取930μl NADPH反应液，加入20μl稀释后AKR1B10，30℃恒温5min后，加50μl底物吡啶-3-醛启动反应。

探索不同稀释比例，至340nm紫外吸收曲线为平直线且斜率数值约为0.2。

最终固定酶AKR1B10浓度为0.5μM左右；
3)配置酶反应溶液
按照步骤2所得酶稀释比例，用NADPH反应液稀释酶至反应浓度(0.5μM)，配成酶反应溶液；
4)化合物IC50测定
为了测试化合物对AKR1B10酶活性的抑制效应，将浓度为1、5、10、25、50和100μM的化合物分别添加到包含重组人类AKR1B10的比色皿中。

按照酶反应溶液：底物溶液＝950:50体积比混合反应体系，测试过程先将酶反应溶液和化合物混合均匀后在30℃下恒温5min后,加50μl底物吡啶-3-醛启动反应。

采用Tecan InfiniteM1000酶标仪在340nm波长下进行5min吸光度测试。

实验结果：将浓度为1、5、10、25、50和100μM的4-(3,5-二甲氧基苯甲酰)-N-(4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)苯酰胺进行AKR1B10的酶抑制活性实验，发现该化合物有很好的抑制活性，其半抑制浓度IC50为6.148μM/L(如图1所示)。

实施例2：化合物4-(3,5-二甲氧基苯甲酰)-N-(4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)苯酰胺对AKR1B1
的酶抑制活性实验。

实验原理：根据辅酶NADPH随着AKR1B1催化醛酮类底物还原反应的进行转化为NADP+这一特点设计。

由于NADPH在340nm处有特征最大紫外吸收峰值，而产物NADP+在此波长处吸收很弱，故可通过检测340nm的紫外吸收值降低来检测辅酶NADPH的消减程度，从而获得酶催化反应的速度。

在反应初始阶段，340nm处紫外吸收变化曲线理论应为直线(零级反应)，斜率与反应速度成正比。

当加入化合物后，反应速度降低，证明化合物对AKR1B1的催化有抑制作用。

实验步骤：
1)配置反应液
用PBS-buffer(0.1M potassium phosphate,pH 7.4)配制浓度0.15mM的NADPH反应液；
2)确定稀释比例
取930μl NADPH反应液，加入20μl稀释后AKR1B1混合均匀后在30℃下恒温5min后，加50μl 底物吡啶-3-醛启动反应。

探索不同稀释比例，至340nm紫外吸收曲线为平直线且斜率数值约为0.2。

最终固定酶AKR1B1浓度为0.5μM左右；
3)配置酶反应溶液
按照步骤2所得酶稀释比例，用NADPH反应液稀释酶AKR1B1至反应浓度0.5μM，配成酶反应溶液；
4)化合物IC50测定
为了测试化合物对AKR1B10酶活性的抑制效应，将浓度为1、5、10、25、50和100μM的化合物分别添加到包含重组人类AKR1B10的比色皿中。

按照酶反应溶液:底物溶液＝950:50体
积比混合反应体系。

测试过程先将酶反应溶液和化合物混合均匀后在30℃下恒温5min,加50μl 底物吡啶-3-醛启动反应。

采用Tecan InfiniteM1000酶标仪在340nm波长下进行5min吸光度测试。

实验结果：实验结果：将浓度为1、5、10、25、50和100μM的4-(3,5-二甲氧基苯甲酰)-N-(4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)苯酰胺进行AKR1B1的酶抑制活性实验，发现该化合物有很好的抑制活性，其半抑制浓度IC50为21.12μM/L(如图2所示)。

实施例3：MTT法检测化合物4-(3,5-二甲氧基苯甲酰)-N-(4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)苯酰胺体外对肝癌肿瘤细胞HCC存活率的影响。

实验原理：MTT，商品名噻唑蓝，全称为
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide。

MTT比色法，是一种检测细胞生存活力的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映存活细胞的数量。

在一定范围内，MTT结晶形成的量与细胞存活数成正比。

实验试剂的准备：肝癌肿瘤细胞HCC细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，MTT购自Sigma-Aldrich公司。

实验步骤：
1)细胞培养
取对数生长期的细胞，按8×103个/孔接种于96孔板，放置于37℃，含5％CO2的细胞培养箱中进行培养。

2)测定化合物对肝癌肿瘤细胞HCC的IC50。

待细胞适应生长12h后，加入100μL含不同浓度化合物的新鲜培养基(化合物的终浓度为125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.90625、1.953125μM)，每个剂量组至少设3个平行复孔，于37℃培养箱中继续培养24h后，每孔加入10μL MTT溶液(0.5mg/mL,PBS配制)，继续培养4h。

2000rmp离心5min，小心弃上清，每孔加入200μL DMSO溶解甲簪沉淀，微型振荡器振荡
10min充分混匀后，用酶标仪在570nm波长下测定光密度值(OD)，并计算细胞存活率及IC50值。

细胞存活率％＝100％-(OD对照组-OD药物组)/OD对照组×100％。

根据计算，能够得在不同浓度的受试化合物作用下细胞的存活率，据此结果绘制曲线，计算该受试化合物诱导50％细胞死亡时的浓度，即为IC50值。

实验结果：将浓度为25、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.90625、1.953125μM的4-(3,5-二甲氧基苯甲酰)-N-(4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)苯酰胺对肝癌肿瘤细胞HCC进行细胞存活率测试，发现该化合物有很好的抑制活性，其半抑制浓度IC50为50.23μM/L(如图3所示)。