单细胞培养

• 看护培养法 • 有些植物细胞，一旦分离出来，不仅不能分裂、增殖，还 可能死亡。看护培养法是用一块愈伤组织来哺育单细胞， 使其正常分裂和增殖的培养方法。用微量移液管或小勺， 将来自悬浮培养物或愈伤组织的单细胞转移到漂浮的定量 滤纸上，滤纸下是旺盛生长的愈伤组织。几天之后，在愈 伤组织看护影响下，在一般培养基中沉寂的细胞开始分裂 生长。
悬浮细胞的特点以及注意事项
• • • • • • • • 特点： 1.能够提供大量的均匀的植物细胞 2.细胞增殖速度快 我们在进行悬浮细胞分批培养时有五个时期分别是：滞后 期、对数生长期、直线生长期、减慢期、静止期。 注意事项： 1.开始的时候尽可能选择使用松散的愈伤组织 2.缩短两次继代的时间可以一直使悬浮细胞保持对数生长。 3.如果处在静止时期的时间过长，则容易引起悬浮细胞的 解体和死亡。
分离单细胞的方法
1.从组织器官中得到单细胞： 1.1机械法：先把叶片轻轻研碎 ，然后通过过滤和离心把细胞净化。 其中一种方法是叶片和研磨介质用研钵轻轻研磨，之后匀浆用纱布过滤， 之后低速离心即可。 优点是：细胞可以不受到酶的伤害，也无须质壁分离。 缺点：适用于那些薄壁细胞组织排列松散，细胞间的触点少。 1.2酶解法：指用专一的水解酶(纤维素酶、果胶酶、琼脂酶等)在温和条 件下分解胞间层，游离细胞。 优点:能够有效的分离单细胞。 缺点：细胞易受到损害。
• 微室培养法 • 人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上， 使其分裂、增殖形成细胞团的方法，称为微室培养法，亦称为 双层盖玻片法。其操作是将携带1个细胞的1滴培养基置于无菌 载玻片上，并用无菌矿物油包围培养基液滴。再分别在培养基 液滴的两侧滴1滴矿物油，在每一矿物油滴上放一张盖玻片。 然后，把第三张盖玻片放在培养基液滴上，并与其他2张盖玻 片相连，在矿物油内形成包含单细胞的无菌微室，矿物油阻止 微室中的水分散失，但允许气体交换。将微室载玻片置于培养 皿中培养，一旦肉眼可见到细胞团，立即揭开盖玻片，转移到 新鲜液体培养基或半固体培养基上继代培养。微室培养法的特 点是：①能够在显微镜下追踪观察单细胞分裂增殖形成细胞团 的全过程；②培养基少，营养和水分难以保持，pH值变动幅 度大，
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• 平板培养法 • 将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种于 适当厚度的薄层固体培养基上进行培养的方法，称为平板 培养。 • 等量的单细胞培养液与等量熔化(30～50℃)的琼脂培养基 (0．6%～1%)混合，迅速铺板于培养皿中，琼脂冷却凝固 后，细胞分布均匀地被固定在薄层(厚度大约1mm)培养基 中。培养皿用石蜡膜封闭，在25℃黑暗或漫射光照射下培 养。培养皿可以在倒置显微镜下观察，用优质记号笔在培 养皿外侧标记单细胞的位置，以便 跟踪观察这些细胞的生 长和再生，确保筛选出纯的单细胞无性系分裂。
• 2.从培养组织中分离出来单细胞: 悬浮培养：是将那些较为松散、呈现绿色的愈伤组织团，将 其尽可能变成小颗粒状态投入到液体培养基中，进行震荡培 养。 2.1分批培养:是较小规模的培养方式，我们在进行悬浮培养 时，会将培养基进行继代培养。当我们从旧的培养基中吸取 培养基注入到新的的培养基中，再补充新的培养基进入到旧 的培养基中，每次吸取量在培养基的1/3左右。
• 细胞悬浮培养法 • 用液体培养基对保持良好的分散状态的单个细胞或小的细 胞聚集体于摇床上进行培养的方法，称为细胞悬浮培养法 (cell suspension culture)。依据培养目的不同，可分为浅 层培养和深层培养。浅层培养是指使培养材料的一部分裸 露于液体培养基表面，采用静止培养的方式，适用于各种 器官和组织的培养。深层培养是将培养材料没入液体培养 基中，同时采用振荡(或旋转)培养的方式，适用于愈伤组织、 单细胞的增殖培养和胚状体的培养。其特点为：①能大量 提供均匀的植物细胞，即同步分裂的细胞；②细胞增殖速 度快，适用于大规模工厂化生产；③需要特殊的设备，如 连续培养装置、倒置式显微镜等，成本较高。
单细胞培养
单细胞培养及其意义
• 单细胞培养(single cell culture)是指从植物器官、愈伤组织或悬浮培 养物中游离出单个细胞，在无菌条件下，进行体外生长、发育的技 术。人们最成功的单细胞培养技术就是从愈伤组织中培育出来的。 • 意义：1、建立单细胞无性系，主要是挑选出来一些具有优良性状 的植物，把其中一些具有合成某中物质强的细胞筛选出来。 • 2、采用生物、化学的方法，对培养的单细胞进行人工诱发突变 • 3、排除体细胞干扰花药培养，由于体细胞干扰影响花药植株高频 发生，同时造成花粉再生群体的复杂性。 • 4、遗传转化受体的建立。
•谢谢
• 2.2分批培养:适用于大型培养。分为封闭培养和开放培养。 • 2.2.1封闭培养：排出旧的培养基的加入新的培养基，排出 液中的颗粒可以经过机械的方法进行回收，重新放到培养 基的系统里。 • 2.2.2开放式培养：注入新的培养基与流出的原有培养基及 其中的细胞容积相同，并通过调节流入和流出的速度，使 培养物的生长速度维持在一个高值的恒定水平中。
由悬浮细胞变为再生植株
• 有两种形式： • 1.悬浮细胞直接形成体细胞胚如胡萝卜 • 2.现将悬浮细胞在半固体培养基培养基上形成愈伤组织， 再分化形成植株。 • 注意：单细胞、低密度的悬浮细胞或者是过于细小的细胞 团来说，则不适宜转到把半固体培养基中，而是选择看护 培养法。 • 半固体培养基是：液体培养基中加入0.2%-0.7%的琼脂。