双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法

电泳完成，得到凝胶
得到X射线片ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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阅读测序结果
一般是从下往上阅 读X射线片上的显 影区带，即从测序 引物的5’端读向 3'端。
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双链DNA 单链DNA
单链DNA
火加加 热入 ，引 退物 ，
带引物的模板单链DNA
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链延伸---终止反应
苷双 脱 氧 鸟
核素标记的dNTP
分成四管
腺双 苷双 苷双 苷脱 脱 脱
氧 氧氧 胸胞
EDTA
乙二胺四乙酸， 一种二价金属 离子螯合剂， DNA聚合酶对 Mg2+浓度十分 敏感。
37℃下反应5min后加入 EDTA使DNA聚合酶失活
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聚丙烯酰胺凝胶电泳特点
精度相当高！能 分离长度达300500个碱基，而 差别仅一个碱基 的同系单链核苷 酸序列。
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操作步骤
1．制备单链模板与引物退火
2．链延伸---终止反应
3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
4. 放射自显影
5. 阅读测序结果
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制备单链模板与引物退火
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DNA复制的特点
酶：DNA聚合酶
底物：dNTP 模板：单链DNA 引物：需要
引物的作用：提供3’羟基
末端
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ddNTP的特点
ddNTP 3’位不是OH，但5’磷酸基 团正常。
DNA聚合酶不 能够区分dNTP 和ddNTP。
ddNTP参入到寡 核苷酸链的3’末端 后，DNA链的延 长会被迫停止。
双脱氧末端终止法
测序的原理
主讲：氧气yun
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Frederick Sanger
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双脱氧末端终止法
DNA聚合酶不能从 头合成子链
如果dNTP的3’碳上 没有羟基
ddNTP——双脱氧 核苷酸
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基本原理：
DNA复制
ddNTP的结构
聚丙烯酰胺凝胶 电泳
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带引物的模板单链DNA
含有各种长度DNA分子的溶液
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聚丙烯酰胺凝胶电泳
95℃加热 变性
冰上冷却
点样 开始电泳
电泳完成，得到凝胶
含有各种长度DNA分子的溶液
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放射自显影
固定凝胶 真空抽干
放入 X射线片夹
与照相机 原理相似， 利用射线 使胶片感 光，然后 通过显影 过程把 “像”显示 出来。