蛋白组学

MS（mass spectrum）质谱法：一种测量离子质荷比的分析方法

tamdam-MS串联质谱：将两个或更多质谱连接在一起。

MALDI（Matrix-Assisted laser Desrption Ionization）基质辅助激光解吸电离离子源：用激光照射样品与基质形成的光结晶薄膜、基质从激光中吸收能量传递到生物分子，而电解过程中将质子转移到生物分子或生物分子得到质子而使生物分子电离的过程

ESI（Electron spray Ionization）点喷雾离子源：属于一种软电离源，能使大质量的有机分子生成多电荷的离子。

2D-DIGE（two dimension difference gel electrophoresis）一种新的荧光标记的定量蛋白质组学技术。利用电荷和分子量的差异分离蛋白质混合物，并通过多通道激光扫描分析不同蛋白质的第二向SDS-PAGE凝胶图像。

zoom gel 变焦镜头凝胶成像：利用百变焦镜头的设备对凝胶进行拍摄成像。

two-in-one-gel 二合一凝胶：将相同PH范围胶条一起进行SDS-PAGE的技术

SILAC（stable isotope labeling with amino acids in cell culture）细胞培养下稳定同位素标记技术）：是在细胞培养过程中，利用稳定同位素标记的氨基酸结合质谱技术对蛋白表达进行定量分析的技术。

CDIT（charge detection ion trap）电荷检测离子阱：一种将离子通过电磁场限定在有限空间内的设备，用于多级质谱分析。

ICAT（Isotope Coded Affinity Taq）同位素亲和标签技术:用具有不同质量同位素亲和标签标记处于不同状态下的细胞中的半胱氨酸，利用串联质谱技术对混合样品进行质谱分析。iTRAQ（isobaric taqs fur relative and absolute guentitation）同位素标记相对和绝对定量技术：该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪分析，可同时比较8种样品间蛋白表达量。

ladder sequencing梯状测序法：用化学探针使蛋白或肽H-N或C端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间无一个氨基酸残基的系列肽，进行质谱检测测序的方法。

tamdam-MS sequencing串联质谱法测序：利用串联后质谱分析进行蛋白测序。

FRET（Forster Resonance energy transfer）荧光能量共振转移：两个距离很近的荧光分子吸收光谱重叠，距离在10nm以内时发生一种非放射性的能量转移。

BRET（bioluminescence Resonance Energy Transfer）生物发光能量共振转移：在一些海洋生物中自然发生一种能量转移现象。

PCA（plate count agar）平板计数琼脂培养基：用于菌落总数测定的一种培养基。

BiFC（Bimolecular fluorecular complementation）双分子荧光互补计数：该计数将荧光蛋白分子的两个互补片段与目标蛋白融合表达，如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用，直观快速判断目标蛋白定位和互补作用。

phage display噬菌体展示：是一种将外源肽或蛋白基团与噬菌体特定蛋白基因在其表明进行融合表达的技术。

far western assay蛋白免疫印迹分析：基于western blot，用能够与目标蛋白结合的非抗体蛋白质，检测蛋白质间的相互作用。

peptide mass fingerprinting肽质量指纹图谱：理论上每个蛋白消化后不同的肽的分子量的图谱

peptide taq肽标签：指那些分子量小，不影响介质蛋白活性的多肽。

proteomecontip蛋白质组重叠群：细胞表达所有蛋白质中彼此可以通过末端重叠序列相互连接形成连接DNA长片段中一组克隆。

Laser capture microdissection激光捕获显微切割：在不破坏组织结构、保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下直接从冰冻或石蜡包埋的组织切片中获取目标细胞。

genome基因组：一个细胞或生物体所携带的一套完整单倍体序列

transcriptome转录组：细胞内所有转录产物集合，mRNA，rRNA , Trna,非编码RNA proteome蛋白组学：一个基因组或一个细胞组织表达的所有蛋白质

expression proteomics表达蛋白组学：把细胞中蛋白建立蛋白定量表达图谱，整体水平上研究生物体蛋白质表达的变化。

differential proteomics 差异蛋白组学：通过寻找各种因素引起的蛋白质表达差异，以解释细胞生理和病理机制。

targeted proteomics 定向蛋白组学：利用质谱仪对一组过预筛选的蛋白质样品进行分析。定向蛋白质组是指对特定已知蛋白质进行质谱检测，而不会像发现蛋白质组那样对所有未知蛋白进行全检测。包括定向和定量。

第一章：蛋白质组学简介

1.why proteomics?为何进行蛋白组研究？

①.蛋白质的重要性

a.蛋白质是细胞中的功能的承载者

b.蛋白质参与了几乎所有的细胞过程，并实现了许多功能

c.从正常状态的偏差是造成疾病

d.蛋白质是药物/治疗靶点

②.全基因组序列的优势：包含了巨大的信息

③.全基因组序列的缺陷

a.基因组序列-完成，不显示蛋白质的功能或生物过程发生

b.DNA、RNA和蛋白质之间的限制关系

c.一种蛋白质的功能往往取决于它的定位

d.一些生物样品不含核酸

④.蛋白质研究本身的重要性

a.蛋白质组反映生物系统状态的动态性

b.翻译后修饰

c.蛋白质折叠成特定的三维结构，确定功能

d.获得选择性剪接的洞察

e.艾滋病在基因组的注释

2.基因组（genome）、转录组（transcriptome）、蛋白组（proteome）三者的区别与联系

联系：total concept，connect by central dogma

区别：gene mRNA protein

static dynamicdynamic

simple complex complex

static:一个有机体从它的发生、发展、到衰老、死亡，不同细胞、组织、器官的基因组是基本稳定不变的。

dynamic：转录组和蛋白组作为基因组转录表达的产物随时间、地点、环境等条件的变化而变化。

complex：由于一个基因有多个转录产物，一个转录产物有多个蛋白。

3.为何一个基因有多种转录产物，一个转录产物有多种蛋白？

①.一个基因有多个转录产物：

a.可变剪切

b.可变启动子

c.聚腺苷酸化的场所选用

d.特殊处理策略

②.一个转录产物有多个蛋白质：

a.启动子与终止密码子可变使用

b.翻译中的修饰

c.翻译后的修饰。

4.正向基因研究策略（forward genetics）：phenotype to gene正向遗传学：通过生物个体或细胞的基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关的表型或性状改变，然后从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能。

反向基因研究策略（reverse genetics）: gene to phenotype反向遗传学(gene knock out, gene knock in)在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组,让其装配出具有生命活性的个体,研究生物体基因组的结构与功能,以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。

5.sequencing complete不等于function known，why？

虽然遗传物质包含所有的细胞功能所需的信息，但是DNA本身不进行细胞内的工作，在生物系统中进行化学和机械工作的蛋白质和调控性催化作用的RNA都是那些基因的产物。

6.traditional protein study和proteome study的区别。

蛋白质组研究本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。

而传统蛋白质研究是对单一蛋白质的结构和功能的研究，具有一定的局限性，无法联系各个蛋白之间的联系和影响。

第二章样品制备(选择\判断题)

1.样品制备的基本步骤

细胞破碎-蛋白提取-去除相互作用-去除杂质

2.细胞破碎方法(区别:剧烈和温和裂解法)

a.剧烈方法：超声破碎、珠磨法、高压匀浆法

b.温和方法：酶法、去垢剂法、快速冻融法、渗透压法（低渗法）

3.（sample extraction buffer）样品制备液中6种主要组分,及其代表

变性剂（Denature reagent）:变性和溶解，尿素、硫脲或者尿素和硫脲的结合

去垢剂（Detergent）:增加疏水性蛋白质的溶解度。兼性离子型：CHAPS，非离子型：Triton、Tween、NP-40，离子型：SDS

还原剂（reducing reagent）：打断二硫键抑制蛋白的氧化作用。带电荷的：DTT、β-ME，不带电荷的：TBP

两性电解质（ampholytes）：维持PH、一致的导电性促进溶解

染料（Dye）：控制开始和运行的条件指示剂：溴酚蓝

蛋白酶抑制剂（protease inhibitors）：抑制蛋白酶活性，PMSF(8mM)

第三章

1.双向电泳基本过程(等电聚焦—平衡—SDS电泳—染色—分析)

2.等电聚焦三种技术

a.ISO-DALT：用载体两性电解质生成PH梯度

b.Non-equilibrium PH gradient electrophoresis:非平衡等点聚焦电泳（半截中止）：重要用于酸性蛋白的分离。解决碱性蛋白质集中存在一点的问题。

c.IPG-DALT: based on immobilized PH gradient(IPG) stripts固定的PH梯度。

3.平衡的目的

将所有蛋白质与SDS偶联以提高从一维转向二维时的转移效果

4.SDS作用

蛋白质变性剂，使分子展开，同时给予蛋白质以负电荷，以去除蛋白质本身电荷所带来的影响。

5.主要染色方法？分辨率约为多少？

染色方法提取度分辨率

考马斯亮蓝100ng 30ng-100ng

负染15ng 15ng

银染200pg 200pg-1pg

荧光染料400pg 0.25-1ng

荧光标记250pg

磷触屏0.2pg

稳定同位素标记＜1pg

分辨率：在凝胶中将斑点分开的能力

6.如何提高分辨率，灵敏度？

提高分辨率：

a.使用更大的凝胶

b.使用非线性的凝胶（非线性PH梯度）

c.放大胶技术：使用多个IEF胶，每个都有很窄的PH范围，然后将他们结合起来。

提高灵敏度：

a.放大胶技术

b.与分级分离或者亲和除去大量蛋白

c.增加染色的分辨率

7.特殊样本（如血液样本、膜蛋白样本）分析的主要问题及解决方法？

低丰度蛋白：太少不能检测到，被高丰度蛋白所掩蔽。

解决办法：提高沉淀量、使用窄PH范围的IPG，移去高丰度蛋白、样品预分级处理

膜蛋白样本：低溶解度

强去垢剂溶解，预分级分离中选择性富集膜蛋白。

血液样本：大多数血液流体中都带有大量存在的蛋白和盐离子

解决办法：透析（除盐离子）、低电压等电聚焦电泳，预分级分离或移去大量存在的蛋白。

第四章

1.可用于样品鉴定的样品信息（Preotein IDs）有哪些？各是如何获得的？三种微测序方法及其原理？

分子量

等电点

氨基酸组成：水解蛋白质-得到氨基酸，计算蛋白质中每种氨基酸的百分含量，在数据库中搜寻与查找。

N-端氨基酸：用PITC标记N末端序列，水解，HPLC分析。

C-端氨基酸：外肽酶加HPLC分析

蛋白质测序：通过TagIdent软件，理论依据：蛋白质末端序列有很高的特异性（N端保守性比C端强，可变性弱）

肽质量指纹图谱

三种测序方法：

N末端测序：Edman降解，用PITC标记N末端序列（PITC属于比较柔的水解，只水解第一个氨基酸）。水解（TFA）。HPLC分析。

C末端测序：外肽酶和HPLC分析

蛋白质测序：重叠消化（胰蛋白酶+Glu-C）和Edman测序

2.质谱仪的基本组成？哪些是离子化源，哪些是质量分析器？质谱和串联质的区别？如何命名质谱？

质谱仪组成：离子化源（Ionization source）、质量分析器(Mass Analyzer)、检测器(Defector)、真空系统、进样系统

离子化源：MALDI（matrix-assisted laser desorption ionization）基质辅助激光解吸电离

ESI（Electro-Spray ionization）静电喷雾离子化

质量分析器：Time-of-Flight（TOF）飞行时间

Quadrapole四级杆

Ion-trap离子阱

检测器：Electron Multiplier(EM)电子倍增器

质谱：一个离子化源+一个质量分析器

串联质谱：一个离子化源+多个质量分析器（中间有碰撞室，将初选得到大的离子进一步碎片化。多个分析器的目的是将母离子碎片化以得到分子的结构星系，也可以允许复制组分中成分的分离和鉴别。

3.常用的质谱信息有哪些？什么是Peptide mass fingerprinting和peptide Tag，两者有何区别？会根据质谱图计算蛋白分子量

常用的质谱信息：质量范围、分辨率、灵敏度、扫描速度、稳定度、质谱图。

peptide mass fingerprinting（PMF）肽质量指纹图谱：用蛋白酶或化学试剂将目标蛋白消化成小肽，用质谱技术测量小肽的质量，将测得的质量与数据库中包含该蛋白序列的片段理论消化产物质量进行比较，然后用统计学方法比对对其进行评估和排名，确定小肽的结构。

将蛋白用酶消化成短肽，用质谱法测得质量，然后从已知序列的数据库中选择蛋白进行理论消化，得到理论短肽质量，两者进行比对，找到相似度最高的序列即可认为与目标蛋白相同。

Peptode tag（肽序列标签）:通过串联质谱法获得的肽的一段信息，可以用来识别蛋白质数据库中的这种肽。aa序列，N-末端片段质量、C-末端片段质量

4.比较MALDI & ESI、Ladder Sequencing & tandem Sequencing、Peptide mass fingerprinting & peptide Tag

ESI和MALDI的区别

MS/MS联用能力强弱

基质干扰无有

质量检测限70KD 300KB

电离方式软电离软电离

是否可用于研究非共价蛋白相互作用可以不可用

ESI适用于微孔径液相层析，适用于三级四级杆分析便于结构分析

电荷与峰谱多电荷、图谱复杂、分子质量测定准确但电荷或双电荷、图谱简单

适用于肽段翻译后修饰难测定肽段分析

分析复杂混合物不适合适合

定量需内标需内标

灵敏度亚fmol-亚pmol亚fmol-亚pmol

盐容忍性差，高反向色谱脱盐较强

杂质容忍性直接进样时差，与液相联用后好较好

Ladder Sequencing:（阶梯测序）

是一种末端降解与质谱技术相结合的序列测定法

原理：N-末端常用化学法，C-末端常用蛋白水解消

化法, , 级联由蛋白或多肽的C- 或N- 末端转化出一系

列片段（每个间相差11个AA的肽序列阶梯) ) ，用质谱分析ladder分子量，由分子量的差别确定AA类型从而测得ladder序列

质谱：FAB，PD(plasma desorption), ESI,MALDI-TOF

优点：高数据获得率、测定时间短、样品需求少、灵敏度高（皮-飞摩尔）

tandem Sequencing（串联测序）

通常一起使用一个以上的质量分析器，目的是从母体离子中的碎片离子提供分子的结构信息，还允许在复杂混合物中的化合物的分离和鉴定，碰撞细胞是在选择的离子被发送进一步的碎片

质量分析分离的多个阶段，可以完成与个别质谱仪在空间上分离的元素，或使用一个单一的质谱仪与时间间隔分离的质谱仪

第六章

1.什么是差异蛋白质组学?主要研究技术有哪些?哪些属于凝胶依赖的技术?哪些属于非凝胶依赖的技术?

差异蛋白组学：通过比较分析不同状态下或近似物种间蛋白质的表达图谱，实现对体内代谢的动态监测，从而揭示机体对内外环境的变化产生的本质规律。

主要研究对象：

①识别蛋白质动态变化或行为

②确定蛋白质的丰度不同，在两个或多个相关样本

③确定不同表达的蛋白质：

a.疾病标志物

b.新的治疗靶点

c.具有相关功能的重要蛋白

主要研究技术：

①2-D聚丙烯酰氨凝胶电泳依赖的：

a. conventional gel 传统的凝胶

b. 2D-DIGE

c. two-in-one gel

②质谱依赖的

a.蛋白的稳定同位素标记

b.无标记定量

③色谱依赖的

a.需要标记的定量模式：代谢标记、化学标记、酶标记

b.不需要标记的定量模式：SELDI、peptide profiles

2.什么是2D-DIGE? Two-in-one-gel?

two-in-one-gel 二合一凝胶：将相同PH范围胶条一起进行SDS-PAGE的技术

3.稳定同位素标记技术有哪些?如何分类?各有何代表?

同位素标记方法：

质谱依赖的：蛋白质同位素标记法

色谱依赖的：

代谢标记：细胞或者个体在富含稳定同位素的培养基或含有稳定标记的氨基酸的介质中生长，稳定同位素随细胞或个体代谢过程掺入合成的蛋白质，使蛋白质被标记。如SILAC.

化学标记：如(ICAT)同位素编码的亲和标签。与含有硫基的蛋白肽反应

酶标记。

体内标记：细胞或个体在含有同位素的介质中生长，稳定同位素被渗入合成的蛋白质，蛋白质被标记。代谢标记、酶标记

体外标记：在体外采用化学反应将合成好的内标与蛋白质结合使蛋白质被标记。化学标记。

4.什么是ICAT? iTRAQ?两者的比较

第七章

1.蛋白质相互作用的研究技术分为哪三个层次?所学的技术分别属于哪个层次?

原子水平、分子水平（二元分子相互作用、多分子相互作用）、细胞水平：蛋白定位

技术层次：

原子：NMR、X射线、免疫染色、电子顺磁共振

分子（二元）：X射线、NMR、竞争性结合、凝胶阻滞分析、ELISA、双杂交、亲和柱、BIAcore、电子顺磁共振、凝胶过滤、质谱筛选、免疫共沉淀、交联

分子（多元）：ELISA、双杂交、亲和柱、BIAcore、免疫共沉淀、蔗糖梯度沉降、质谱筛选、凝胶过滤层析、共纯化

细胞：免疫沉淀、免疫荧光共振、免疫定位、免疫染色、FRET、单克隆抗体阻塞、粘附相互作用分析、敲除、反义、短暂的共表达。

2.杂交技术的原理，主要问题，改进方式

原理：通过转录因子和上游激活元件结合激活下游报告基因的转录与表达来研究蛋白与蛋白、蛋白与DNA的相互作用。当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。

转录激活因子在结构上是组件式的,由两个(或以上)相对独立的结构域组成--DNA结合结构域(BD)和转录活化结构域(AD)。

两结构域建立空间联系是转录激活的关键，而单独作用无法激活转录过程。

分为：酵母（单、双、三、反、核外）杂交系统、哺乳动物杂交系统、细菌杂交系统。

主要问题及改进方式

①核内作用：不适于胞外受体配体作用及需要核外加工修饰等翻译后介导的蛋白质作用，也不适于膜蛋白。

改进：改变某些细胞膜定位序列

在载体中添加核定位信号序列

专门研究非核内蛋白作用的系统（如SOS恢复系统和泛素专一性蛋白酶系统等）

②假阳性：靶蛋白本身含转录活化成分，即preyAD自身可激活报告基因转录。

诱饵蛋白本身有激活作用,即BaitBD自身可激活报告基因转录。

preyAD对baitBD无特异性

未被发现的调控途径激活报告基因，

杂交设计的原因：暴露区域暴露，时空破坏

某些蛋白是依赖于遍在蛋白的蛋白酶水解途径成员，具有普遍蛋白间相互作用能力

改进：对照实验

RNA聚合酶Ⅲ转录基础上的双杂交系统

含三种不同的报告基因(ADE2，HIS3和LacZ)的酵母PJ69-4A菌株

③假阴性：融合蛋白对细胞有毒性，对于蛋白间相互作用效弱

改进：选敏感性低的菌株或拷贝数低的载体

采取共转化的方法

选高敏感菌株或高拷贝载体。

④转化率低（比细菌低4个数量级）

改进：共转化

酵母两性接合：将诱饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接合型单倍体酵母中再杂交

3.什么是展示系统？展示系统如何分类？哪些属于细胞依赖的展示方式？哪些属于非细胞依赖的方式？

将外源肽或蛋白基因与噬菌体、细胞、细菌、真菌等特定蛋白基因在表面进行融合表达，且被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性，展示在细胞或受体的表面的技术，用以实现表型与基因型的统一。

细胞依赖（cell based）：

噬菌体展示（phage display）

细胞展示（cell display）：

①细菌展示（Bacterium display）

②酵母展示（Yeast display）

③哺乳动物细胞展示（Mammalian cell display）

非细胞依赖（cell free）：

体外展示（in vitro display）

①核糖体展示（Ribosome display）

②mRNA展示（mRNA display）

③DNA展示（DNA display）

4.区分单价展示（monodisplay）和多价展示(multiple display)？全展示(full display)和杂合展示(hybrid display)？

多价展示还是单价展示的选择与载体类型的选择有关。带有噬菌体正常启动子的普通噬菌体载体一般会形成多价展示，除非被展示蛋白被大量酶解。另一方面，使用能在一个弱(或非诱导性)启动子的调控下将蛋白展示在pⅢ蛋白上的噬菌粒载体上，通常会导致被称为“单价展示”的结果。

5.亲和依赖的蛋白质相互作用方法有哪些？各自的原理是什么？

①Tags Pull-Down ：GST, His, Flag, HaloTag

用树脂固定标记的用以拉下的相互作用的蛋白质。用标记示综的方式将诱饵以特殊结构捆绑蛋白质，在裂解液或其他包含蛋白的混合液中将目标蛋白纯化出来

②Far-western analysis：

与western blotting类似，只有一个关键点不同。在一种典型的western blotting 检测中抗体蛋白探针用一种示踪的诱饵蛋白作为探针。通过显示交互蛋白的元件的相互作用来表现受体配体的相互作用。

③免疫共沉淀：体内或体外

免疫共沉淀是用特异性结合特定蛋白的抗体来沉淀一种蛋白质抗原的技术，将抗原捆绑到特定的蛋白上。将抗体捆绑到已知的蛋白形成蛋白复合体来鉴别复合体的未知部分。

④Protein Affinity Chromatography（蛋白亲和层析）

6.活体细胞内蛋白相互作用研究方法有哪些（Direct imaging of protein-protein interactions in living cells）？

7.什么是FRET？BRET? PCA? BiFC? BRET-BiFC？BiFC-FRET? 如何用相应的技术研究蛋白相互作用？（What is Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)? How to use it to detect the interactions in a protein complex?）

FRET（荧光共振能量转移）：当两个蛋白分子相互作用，一个蛋白标记的供体荧光基团的荧光发射光光谱与另一个蛋白标记的受体荧光基团的激发光谱相重叠，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，随着距离延长，FRET呈显著减弱。

BRET（化学发光共振能量转移）：当两个蛋白分子相互作用，一个蛋白融合表达的供体萤光素酶蛋白酶学反应产生的的发光信号光谱与另一个蛋白标记的受体荧光基团的激发光谱相重叠，诱发受体分子发出荧光。

BiFC（双分子荧光互补技术）：是利用绿色荧光蛋白产生的荧光验证蛋白之间的互作、检测其互作强弱以及定位蛋白互作位点的一项新技术.将蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端2个多肽，称为N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)。这2个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发地组装成完整的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时不能产生荧光。但是，当这2个荧光蛋白的片段分别连接到1组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这2个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光激发下，发射荧光。简言之，如果目标蛋白质之间有相互作用，则在激发光的激发下，产生该荧光蛋白的荧光。反之，若蛋白质之间没有相互作用，则不能被激发产生荧光。