放线菌筛选的一般方法

拮抗香蕉枯萎病放线菌的筛选与AM2041菌株的鉴定

拮抗香蕉枯萎病放线菌的筛选与AM2041菌株的鉴定本实验从海南各地采集土壤样本，从中筛选出具有对foc4拮抗作用明显的1株放线菌，并对其进行形态、生理生化、16s rdna序列及系统发育分析等方面的监督。

一、材料与方法1.供试菌株的分离菌株的分离采用高氏一号合成培养基。

在海南省海口、儋州、临高等地的8个香蕉种植园，选择香蕉枯萎病发病症状明显的香蕉树，在根系地表采集约20g土壤作为样本。

样本去除大块固体，放置在通风橱中风干10天。

每个样本称取1g，加入9ml无菌水，28℃、200r/min摇床上恒温培养一天，制成悬浮液。

静置1h后分别取上清100μl，进行101、102、103、104梯度的稀释。

稀释液分别取100μl进行涂板，每瓶重复3次。

培养皿28℃培养3天，挑取单菌落于平板上进行划线纯化，5天后进行观察。

2.拮抗菌株的筛选以本实验室所保存的菌液浓度约为109个/ml的foc4培养液作为检测样本，以琼脂挖块法进行初筛：pda平板上接种foc4培养液0.1ml,涂布均匀。

将分离得到的单菌落接种到新的pda平板上，28℃恒温培育2天，用5mm孔径的打孔器打孔，挑取带菌琼脂块放置于有foc4培养液涂布的pda平板上，每个菌株重复3次，28℃恒温培养36小时。

观察抑菌圈的情况。

筛选出的抗性作用明显且生长状况良好的菌株进行复筛。

将抗性菌株接种于snb培养液[11]中进行发酵，28℃、200 r/min摇床上恒温培养一天，室温静置1小时。

在pda平板上均匀涂布0.1ml foc4培养液后，将无菌的直径5mm滤纸贴在平板上。

取10μl抗性菌株的发酵液上清滴于滤纸中心，每个菌株重复3次，28℃培养1天。

观察菌落生长状况。

3.抗性菌株的分类鉴定形态学鉴定：将选出的抗性菌株分别接种于高氏一号合成培养基、甘油天门冬素培养基、土豆琼脂培养基、酵母粉葡萄糖培养基、燕麦汁培养基，28℃培养7天，观察记录菌株气生菌丝、基生菌丝的颜色及有无可溶性色素产生。

一株拮抗放线菌菌株的筛选与鉴定

一株拮抗放线菌菌株的筛选与鉴定郭春燕;王旭正;刘少杰;于金凤【摘要】采用平板对峙法与灰色关联度分析法从小麦和苹果根际土壤中筛选出对小麦纹枯病(Rhizoctonia cerealis)和小麦根腐病(Bipolaris sorokiniana)具有良好拮抗作用的放线菌,并依据菌落形态和培养特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析等进行鉴定.结果表明,菌株FX-H-51抑菌效果显著,对不利生长环境有良好的耐受性.形态学与分子鉴定结果表明,菌株FX-H-51为海棠链霉菌(Streptomyces spectabilis).%Actinomycetes with strong antagonistic activity against Rhizoctonia cerealis and Bipolaris sorokiniana were screened out from wheat and apple rhizosphere soil by plate confrontation method and grey correlation degree analysis. They were identified according to the colony morphology and culture characteristics, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence. The results showed that the FX-H-51 strain had significant antibacterial effect and better tolerance to the unfavorable growth environment. The morphological and molecular identification results indicated that the FX-H-51 strain was to Streptomyces spectabilis.【期刊名称】《山东农业科学》【年(卷),期】2018(050)004【总页数】5页(P43-47)【关键词】放线菌;灰色关联度分析;拮抗活性;海棠链霉菌【作者】郭春燕;王旭正;刘少杰;于金凤【作者单位】山东农业大学植保学院植物病理学系,山东泰安 271018;山东农业大学植保学院植物病理学系,山东泰安 271018;山东省烟台农业学校,山东烟台265100;山东农业大学植保学院植物病理学系,山东泰安 271018【正文语种】中文【中图分类】S154.3放线菌是陆生性较强的原核生物，同时也是一类具有重要经济价值和生物研究价值的微生物资源，其中链霉菌属(Steptomyces)的放线菌在植物病害生物防治中已有较多的研究报道。

放线菌筛选的一般方法

放线菌筛选的一般方法1.放线菌样本的收集：可以从自然环境中收集土壤、植物、水体等样本，也可以从实验室中保存的菌种库中选取菌种作为筛选对象。

2.放线菌的分离：将收集到的样本通过稀释涂布、均匀涂布等方法进行分离。

将分离出的放线菌菌落定植于选择性培养基上，利用差异营养需求、抗生素抑制等原理，筛选出纯培养基。

3.放线菌培养：将分离出的纯净菌株接种到适宜的培养基上进行培养，包括液体培养和固体培养。

液体培养可以用于代谢产物的筛选，固体培养主要用于菌株保存和鉴定。

4.代谢产物的筛选：通过对放线菌培养液或菌体提取物的分离、纯化和结构鉴定，筛选出具有生物活性的代谢产物。

常用的筛选方法包括生物测定法、波谱分析法等。

其中，生物测定法是通过对目标活性的生物测定，如抗菌活性、抗肿瘤活性、抗炎活性等，筛选出具有生物活性的化合物。

5.进一步筛选与优化：在获得具有初步生物活性的代谢产物后，可以进一步对其进行筛选与优化。

可以通过改变培养条件（如培养基、温度、pH值等）、发酵工艺等方式提高活性代谢产物的产量和纯度。

6.结构鉴定：对优选的生物活性代谢产物进行结构鉴定，通常使用核磁共振谱、质谱、红外光谱等波谱技术进行分析。

结构鉴定有助于揭示生物活性物质的药理作用机制，为后续研究提供基础。

7.生产量扩大与优化：当获得了具有潜在药用价值的放线菌菌株和代谢产物后，可以进行大规模的发酵生产以提高产量。

在此过程中，需要不断优化发酵工艺、培养基成分和培养条件，以提高产量和纯度。

综上所述，放线菌筛选的一般方法包括放线菌样本的收集、放线菌的分离、放线菌培养、代谢产物的筛选、进一步筛选与优化、结构鉴定和生产量扩大与优化。

这些方法的应用能够帮助科学家发现新的放线菌菌株和生物活性化合物，并为新药研发提供重要的基础信息。

如何在丝状放线菌中进行高通量筛选

如何在丝状放线菌中进行高通量筛选引言丝状放线菌是一类广泛分布在自然界中的细菌，具有丰富的次级代谢产物，如抗生素、抗肿瘤药物和其他活性物质，是重要的工业和医药微生物资源。

为了提高丝状放线菌的产物合成能力和多样性，需要对其进行基因工程改造，引入或调控相关的基因或代谢途径。

然而，由于丝状放线菌的基因组复杂、转化效率低、表达调控复杂等原因，传统的基因工程方法往往效率低下、耗时耗力。

因此，需要开发高通量筛选方法，快速寻找优良的菌株或基因，从而提高丝状放线菌的菌种改良和产物开发效率。

高通量筛选方法的概述高通量筛选是一种快速处理大量样品，并从中筛选出最佳候选者的方法。

在丝状放线菌中进行高通量筛选，主要有以下几个步骤：•菌株的构建：利用不同的基因编辑技术，如同源重组、CRISPR-Cas9等，对丝状放线菌的基因组进行改造，引入或敲除相关的基因或代谢途径。

•菌株的培养：利用不同的培养条件和诱导剂，对构建好的菌株进行培养，使其表达或合成目标产物。

•菌株的分析：利用不同的检测方法，如紫外吸收法、荧光法、色谱法等，对培养好的菌株进行分析，评估其产物的含量或活性。

•菌株的分选：利用不同的分选方法，如微孔板培养分析法、生物测定法、抗生素生存筛选法、荧光激活细胞分选法（FACS）、荧光激活液滴分选法（FADS）等，从大量的菌株中筛选出最佳的候选者。

高通量筛选方法的比较不同的高通量筛选方法有各自的特点和适用场景，以下对比了五种常用的高通量筛选方法：•微孔板培养分析法：这种方法是利用微孔板进行菌株的培养和产物的分析，可以同时处理多个样品，提高筛选效率。

微孔板的每个孔都可以作为一个微型反应器，可以加入不同的菌株、培养基和诱导剂，进行不同条件下的菌株培养。

培养结束后，可以利用不同的分析方法，如紫外吸收法、荧光法、色谱法等，对微孔板中的产物进行定性或定量的检测，从而评估菌株的产物含量或活性。

这种方法的优点是可以同时处理多个样品，节省时间和空间，且可以利用现有的仪器和耗材，无需特殊的设计和制作。

菌种选育

菌种的营养特征独特
生长特征独特
选择性分离
无选择性特征
根据产物的特征进行
随机分离
选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，
从而实现定向富集筛选。
选择性分离原理和技术

生长条件的选择与控制原理
控制营养成分
控制培养基酸碱度
添加抑制剂
控制培养温度
控制通气条件

选择性分离技术
施加选择压力，进行定向筛选
个平板上铺上一种试验菌。
A.富集液体培养
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术

技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株
生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件

培养方式分批培养方式：以最大比生长速率（μ max）筛选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题
连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选

高产培养基设计的几个原则
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素；
使用一聚合或复合形式的生长限制养分；
避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物
阻遏；
确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH缓冲剂以减少pH变化；前体、促进剂及抑制剂的采用。
培养基中加入新生霉素(25µ g/mL)和亚胺环己酮(50 µ g/mL)
能分离出普通高温放线菌。
菌种的培养
温度和时间两方面，主要变量为时间。
培养温度：放线菌25～30oC，嗜热菌45～55oC，嗜冷菌4～10oC。培养时间：是培养的主要变量，嗜温菌（链霉菌和小单孢菌）7～14d；嗜热菌（高温放线菌）1～2d。

烟草青枯菌拮抗放线菌的筛选及鉴定

ＡｇｉｒｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９３，Ｃｉｎｈａ；４．ＣｉｔｙＧｒｅｅｎｉｎｇＭａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆＸｉｎｙａａｎｇ，Ｘｉａｎｙｎｇａ，Ｓｈｎｘａｉ７１２０００，Ｃｈｉｎａ；５
中国烟草科学
ＣｈｉｎｅｓｅＴｏｂａｃｃｏＳｃｈｉｎｅｓｅ
２０１３０４，３４（２）
烟草青枯茵拮抗放线菌的筛选及鉴定
陆铮铮，一，彭丽娟１，２丁海霞，左希，彭杰，蒋选利 ’
（１．贵州大学贵州山地农业病虫害重点实验室，贵阳５５００２５；２．贵州大学农学院，贵阳５５００２５；３．中国农业大学农学与生物技术学院，北京１００１９３；４．咸阳市城市绿化管理处，陕西咸阳７１２０００；５．天柱县烟草专卖局，贵州天柱５５６６００）
链霉菌平均抑菌圈直径为２０．３４ｍｍ。
关键词：烟草；青枯病；生物防治；放线菌中图分类号：￥５７２．０８文章编号：１００７ — ５１１９（２０１３）０２ — ００５４ — ０５ＤＯＩ：１０．３０７ — ５１１９．２０１３．０２．０１２
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｓｅｌｅｃｔｅｆｅｃｔｉｖｅａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓａｇｉｎａｓｔＲａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ，ｗｅｉｓｏｌａｔｅｄ５６ｓｔｒａｉｎｓｏｆ

酱香白酒酿造过程放线菌的筛选与风味研究

酱香白酒酿造过程放线菌的筛选与风味研究酱香型白酒酿造历史悠久,工艺独特,开放式的固态发酵造就了复杂而又特殊的酿酒微生态系统,最终形成酱香型白酒独一无二的酒体风格。

酱香型白酒酿造体系微生态系统研究是科学认识酱香型白酒发酵中所蕴藏生物学问题的关键之一。

放线菌作为酱酒酿造中的主要微生物之一,既有风味特征作用又有微生态功能作用。

放线菌与产酱香功能细菌之间的微生态研究及风味影响机制分析,有利于深入研究酱香型白酒发酵机理,促进酱香型白酒进一步发展。

本研究从产异味的放线菌出发,以探究白色链霉菌亚种(Streptomyces albus subsp.)(编号A22)与产酱香功能解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)(编号B6)发酵体系中风味影响机制为目的。

通过对产异味放线菌的筛选及鉴定、酿造环境胁迫条件耐受性、特征代谢产物以及对产酱香功能细菌特征代谢风味成分影响等方面进行了研究,取得了如下的结果:(1)通过对酱香型白酒酿造过程中放线菌初筛得到30株,再通过固态发酵感官闻香,筛选到一株产异味突出的菌株(编号A22),经多相分类鉴定为白色链霉菌亚种(Streptomyces albus subsp.)。

(2)对A22菌株进行主要酿造环境胁迫条件耐受性进行分析,结果表明:A22菌株能耐45℃高温、4%vol乙醇、pH4.0环境,其对主要酿造环境胁迫条件适应性较好。

(3)通过HS-SPME和GC-MS对B6、A22、A22B6固态发酵代谢产特征性风味成分进行定性定量分析,结果表明:A22代谢所产土臭素是发酵醅中异味的主要来源,为关键特征性成分;功能细菌B6代谢所产吡嗪类物质是酱酒中的健康功能成分,高温有利吡嗪类总量和种类的增加;混菌发酵时,B6抑制A22产土臭素,发酵醅异味得到调节,风味得到改善,正常酿造条件调节减少酒醅异味;混菌发酵时,A22抑制B6产吡嗪类总量,从风味角度来说A22对B6吡嗪代谢具有一定的调节作用。

放线菌的分离与筛选方法

放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。

腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。

放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。

1.拮抗放线菌的筛选方法：1.1平板划线法：待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。

如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。

可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。

选择抑制活性强的复筛。

1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。

若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。

若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。

1.3纸片法或生长速率法：主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有无抑菌圈或抑菌圈的大小。

2.放线菌分离与筛选.2.1培养基；2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。

2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速度迅速。

放线菌的分离

实验五：土壤中放线菌的分离实验学时：5学时实验类型：验证性实验、综合性实验实验要求：必修一、实验目的从土壤中分离、纯化放线菌；初步掌握药用微生物的分离纯化方法和操作技术。

了解不同生境条件中土壤放线菌的种类与数量。

二、实验内容筛选放线菌永远是新抗生素研究的课题之一。

迄今为止，已发现的抗生素约有80%来自于放线菌。

土壤中放线菌最丰富，品种齐全。

通常情况下，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。

随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。

从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线菌，从淡水和海洋环境中可分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。

土壤中含有的放线菌主要是链霉菌，人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。

但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离方法很难得到。

对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾等方法可以减少细菌和真菌的数量，以提高放线菌的获得率。

用干热和苯酚处理可减少链霉菌数量和比例的方法，可以分离得到更多种类的放线菌。

土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法来获得放线菌。

注：从土壤中分出的放线菌要进一步鉴别是否为抗生菌。

首先应根据筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。

常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。

其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。

抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。

三、实验原理、方法和手段原理一：稀释涂布平板法；如图1。

原理二：对样品进行风干、干热处理以减少细菌和真菌的数量；原理三：向培养基添加适量的重铬酸钾能抑制其他细菌、真菌的生长，但不影响放线菌的生长。

四、实验组织运行要求根据本实验的特点、要求和具体条件，采用“采用集中授课形式，分组试验进行”的组织运行模式。

菌种筛选方法

常用的菌种的筛选方法如下：（1）施加选择性压力分离法主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势。

而得以快速分离纯化的目的。

如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。

在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。

如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。

（2）随机分离方法有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。

A、抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。

实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。

B、抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。

原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。

B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。

B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。

C、生长因子产生菌的分离以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。

首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中，培养2-3天后，用紫外线杀司长好的菌落，再往此平板上面铺一层相应营养缺陷型菌株菌悬液，培养16小时后，被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈。

具有群体感应抑制活性海洋放线菌的筛选与鉴定

生命科学与实验研究生物技术^世界具有群体感应抑制活性海洋放线菌的筛选与鉴定刘颖王梅梅侯志红姜峰朱丽华甄永占李娟熊亚南*(华北理工大学基础医学院河北省慢性疾病重点实验室唐山市慢性病临床基础研究重点实验室河北唐山063000)摘要:目的:从海洋放线菌中筛选得到具有群体感应抑制活性菌株，并对其进行鉴定。

方法:利用紫色杆菌C V 026指示菌株对放线菌发酵粗提物进行活性筛选。

其次通过16SrD N A 序列比对进行菌种鉴定。

结果:其发酵提取物经紫色杆菌C V 026模型筛选后，发现放线菌J 501提取物具有群体感应抑制活性，且在有效浓度时对细菌的生长没有影响。

16SrD N A 分析表明J 501属于Streptomyces 属。

结论:海洋放线菌中有具有抑制细菌群体感应效应的菌株，是天然群体感应抑制剂的潜在来源。

关键词:紫色杆菌C V 026海洋放线菌群体感应紫色菌素中图分类号:Q 93 文献标识码:A文章编号:1674-2060(2015)09-0010-02细菌感染严重威胁着人类的健康,因此对细菌感染的治疗一直受到人们的广泛关注。

自抗生素发现之后，其对致病菌的抑制作用，使之成为人类治疗细菌感染的主要措施。

而随着人类抗生素滥用，耐药病原菌数量日益增长，传统抗生素治疗感染性疾病已难达到预期效果[1]。

因此，寻求一种新型抗生素药物或抗菌策略来对抗耐药菌株引起的感染疾病成为抗感染治疗新的研究热点。

群体感应(quomm -sensing ，QS )是细菌根据细胞密度变化进行基因表达调控的一种生理行为。

随着细胞密度增加，细菌产生的信号分子浓度逐渐增加，当信号分子积累到一定浓度时会启动相关基因的表达,如共生、细菌毒性、竞争、接合、抗生素的产生、运动性、孢子及生物膜的形成等[2]。

通过抑制细菌QS 来降低细菌的毒力和致病性，不易对致病菌形成选择性压力，病原菌不易对其产生耐药性[3]。

海洋微生物资源丰富，且其高盐、低温、高压等特殊环境造就了海洋微生物种类的特殊性，使其具有能产生不同于陆栖微生物的活性物质[4]。

抗FOC4香蕉内生放线菌的筛选及菌株NJQG—3A1鉴定

抗FOC4香蕉内生放线菌的筛选及菌株NJQG—3A1鉴定1材料与方法1.1材料1.1.1病原菌尖孢镰刀菌4号生理小种，由中国热带农业科学院生物技术研究所曾会才实验室提供。

1.1.2主要培养基内生放线菌分离培养基采用改良高氏（Gauses）1号培养基（GS）、1/10 ATCC 合成培养基、葡萄糖天门冬酸培养基（GA）、腐殖酸培养基（HV）、改良高氏2号培养基（GPT）和改良淀粉酪素培养基（SIM）[14-18]，为抑制杂菌生长，在各分离培养基中均加入终浓度为75 mg/L的重铬酸钾、100 mg/L的制霉菌素和20 mg/L的萘啶酮酸；放线菌纯化培养保存采用YE培养基；抑菌试验采用马铃薯琼脂培养基（PDA）；液体发酵采用淀粉-大豆粉液体培养基；形态特征观察采用国际链霉菌计划（ISP）推荐的培养基，参考Shirling等的方法[19-20 ]进行配制。

1.1.3样品采集与处理2012年11月3日从海南省临高南宝蕉园（19°47′1″N，109°51′17″E）和皇桐蕉园（19°49′58″N，109°50″E）采集香蕉植株样品（表1）。

每个品种随机采集香蕉植株10株，混匀。

表1样品采集信息采集地点根部土壤pH值香蕉植株采集植株部位皇桐美台蕉园4.35农科健康植株（NK）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园4.17南天健康植株（NJ）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园5.54南天感病植株（NB）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园4.17巴西健康植株（BJ）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园5.54巴西感病植株（BB）根、球茎、假茎、叶1.2方法1.2.1内生放线菌的分离参考阮继生分离弗兰克氏菌的方法对样品进行表面消毒，采用组织块匀浆法进行内生放线菌分离。

1.2.2香蕉枯萎病内生拮抗放线菌筛选以尖孢镰刀菌4号生理小种（FOC4）为靶标菌，采用平板对峙法进行初筛；对初筛有活性的菌株用平板对峙法进行复筛，计算抑菌率，公式为：抑菌率=[（对照组菌落半径-处理组菌落半径）/对照组菌落半径]×100%。

放线菌菌落特征放线菌资料的总结

放线菌菌落特征放线菌资料的总结放线菌菌落特征放线菌资料的总结放线菌的形态比细菌复杂些，但仍属于单细胞。

在显微镜下，放线菌呈分枝丝状，我们把这些细丝一样的结构叫做菌丝，菌丝直径与细菌相似，小于1微米。

菌丝细胞的结构与细菌基本相同。

根据菌丝形态和功能的不同，放线菌菌丝可分为基内菌丝、气生菌丝和孢子丝三种。

链霉菌属是放线菌中种类最多、分布最广、形态特征最典型的类群，其形态如下图所示。

下图:链霉菌的一般形态和构造(模式图)正文:放线菌是怎么生长的，需要什么条件，我指的不是培养基，而是在植物体内。

哪位做过植物内生菌，恳请指教!不胜感激!植物内生放线菌在植物的韧皮部、木质部和韧皮部之间的缝隙有生长，分离植物的内生菌通常在这两个部位可以分离到。

主要是靠植物组织提供营养，有很多内生菌能够分解纤维素作为炭源，无机盐和氮源可以由植物组织中的无机盐和含氮物质获得，他们在植物中生长很缓慢。

通常来说，植物或者植物的组织器官的生长时间越长内生菌的种类和数量越多，你如果要分离可以选择树龄在百年以上的树。

植物器官粉末中会有放线菌存在吗?干燥的，经辐射灭菌后的粉末会把放线菌杀死吗?适宜的条件还会长出菌吗?辐射灭菌和50-60度的干燥都不能杀死所有的放线菌。

另外植物当中不只有放线菌，植物的内生菌大多数是真菌，有的内生真菌产生孢子能够抵御不良环境，生存能力很强。

如果你是做植物组织化学可以采用高温处理，杀死植物当中的微生物，再分析植物组织的成分。

如果你要的成分不能高温处理，可以用容易挥发的消毒剂处理植物样品，杀死微生物然后，在无菌环境下使消毒剂挥发。

建议你采用75%乙醇。

如何分离内生菌?目前内生菌的分离主要还是表面消毒，建议你最好不要把植物组织研磨成粉末。

可以将组织用75%乙醇表面消毒，在无菌室中的超净台中将植物组织吹干，用消毒的手术刀，把植物组织切割成0.5*1cm的小块。

直接把组织块接入培养基，同时将组织小块在空培养基中滚动，然后取出，作为对照平板。

放线菌菌种筛选的一般流程

菌种筛选的一般步骤________、_________、________。

答案：菌种的分离和筛选一般步骤分为采样、富集、分离、目的菌的筛选四个步骤。

知识拓展：
放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中。

分离和纯化土壤中放线菌的实验流程如下：土壤取样→系列稀释→涂布平板→恒温培养→观察菌落→菌种纯化。

回答下列问题：（1）取样时应选择有机物含量丰富且疏松的土壤，可判断大多数放线菌属于____（填“需氧菌”或“厌氧菌”）。

将1g土样放入盛有99mL无菌水的锥形瓶中混合均匀，再取1 mL 土壤悬液注入盛有9 mL无菌水的试管中，则该试管中稀释液的稀释倍数为____倍。

（2）高氏1号培养基是培养放线菌的常用培养基，该培养基含有的营养物质主要包括____。

（3）在分离土壤中的放线菌时，为减少细菌和真菌的干扰，提高放线菌的分离效率，在培养基中要加入一定量的重铬酸钾，重铬酸钾在培养基中所起的作用是____。

（4）放线菌的培养温度一般应____（填“低于”或“高下”）细菌的培养温度。

（5）筛选放线菌可根据菌落特征进行判断，菌落特征主要包括____（答两点）等方面。

（6）分离得到土壤中的放线菌后，可利用____法对菌种进行纯化。

答案：(1). 需氧菌(2). 103（或1000）(3). 碳源、氮源、水和无机盐(4). 抑制细菌和真菌的生长（或选择作用）(5). 低于(6). 形状、大小、颜色和隆起程度(7). 平板划线或稀释涂布平板。

放线菌的分离和鉴定

放线菌的分离和鉴定实验器材：1.土壤材料 5 ---10cm 处土壤，放于采集袋中带回实验室。

2.培养基淀粉琼脂培养基（高氏Ⅰ号培养基( w /v)）可溶性淀粉2%，KNO3 0. 1%，NaCL 0. 05%，K2HP04 0. 05%，MgSO4 0. 05%，FeSO4 0. 001%，琼脂2% 3.溶液和试剂（1) 20% 甘油( 2) 0. 1%美蓝 A 液: 美蓝0. 3g ，95% 乙醇300ml;B 液: 0. 01% KOH 100ml 混合A 和B 液即成革兰氏染液3( 1) 结晶紫染色液: 甲液结晶紫2g，95% 乙醇20ml;乙液草酸铵0. 8g，蒸馏水80ml。

甲乙液先分别溶解，然后混合在一起，过滤除去残渣后装入滴瓶中备用。

( 2) 碘液: 碘1g，碘化钾2 个，蒸馏水100ml 先取少量蒸馏水加入碘和碘化钾，使碘完全溶解后再加入全部蒸馏水，分装于滴瓶中备用。

( 3) 复红酒精溶液: 碱性复红0. 4g，95%乙醇100ml，溶解装入滴瓶备用。

4.仪器和其他用品无菌纸、带玻璃珠的三角烧瓶、1ml无菌吸管、无菌试管、无菌培养皿一.目的要求：1. 掌握倒平板的方法和常用分离纯化微生物的基本操作。

2. 初步观察土壤中放线菌菌落形态。

3. 初步了解掌握微生物分类的基本方法。

二.实验原理：放线菌在自然界中主要生存于陆地和淡水中，土壤为这类微生物的主要习居场所，无论在种类和数量上都比其他地方繁多。

在中性或偏碱性的土壤和有机质等丰富的土壤中较多。

放线菌以孢子和菌丝片段的形式存在于土壤，每克土壤内含有数万、数十万的孢子。

放线菌的生活史和形态特征放线菌的孢子和孢囊孢子在适宜的环境下吸收水分，膨胀萌发，生出芽管1 －3 个，芽管伸长长出分枝，分枝越来越多，形态菌丝体。

因其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。

基内菌丝体一般没有横隔，由于菌丝体长入培养基内和培养基表面，并纠缠在一起形成密集的菌落，所以用接种针将整个菌落培养基挑起而不破裂。

植物病原菌拮抗放线菌的分离筛选与鉴定

Kauffmann等[10]方法，琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统中平板法测定它们对2种植物病原细菌的拮抗作用，其中3株
检测其纯度。以基因组DNA为模板，采用细菌通用引物菌具有抑菌活性，结果(见图1)显示：W04、W01、W2R对水
27F(5'-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3')和1527R(5'- 稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌都有不同程度的抑
cinerea 、菜豆炭疽病菌Colletotrichum sp.、黄瓜立枯病菌Fusarium solani 、烟草赤星病菌Alternaria alternata 、绿色木霉Trichoderma viride 、番茄叶霉病菌Fulvia falva 、水稻纹枯病菌R h i z o c t o n i a s o l a n i 、水稻白叶枯病菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 、水稻细菌性条斑病菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzicola 、镰刀霉菌Fusaria 、无名假丝酵母Candida famata ，以上均为浙江工业大学微生物实验室保存菌种。
1.2.2 放线菌菌体对植物病菌的拮抗作用
(bootstrap)为1 000次重复。
采用平板对峙法测Βιβλιοθήκη [5] 定放线菌对植物病原真菌的抑
3)培养特征及生理生化特性
菌效果：将培养好的植物病原真菌用打孔器打取直径
在部分培养特征培养平板上划线接种菌株W04，
为5 mm的菌块，然后将其倒置放在PDA平板中央，距中 28 ℃培养7~15 d后观察记录菌落特征[11]，并进行碳源、纤

土壤多重抗生素抗性放线菌的筛选及其发酵产物的初步研究

ｓｒｉｓ，Ｎｏ．１ｃｉｏｍｙｅｅｔａｎｅｈｂｔｈｉｅｔａｔｉｒｉｌａｃｉｉｇｎｔＢａｃｌｓｓｂｔｉｔａｎａｔｎｃｔｓｒｉｘｉｉｅｄｔｅｈｇｈｓｎｉｃｏｂａｔｔａａｉｓｍｖｙｉｕｕｉｓｌｌＡＴＣＣ６３ａｎＭｉｒｃｃｓｕｅｓ６３ｄｃｏｏｃｕＪｔｕＡＴＣＣ９３ｗｉａｎｂｔｎｏｎｏ２５ａｎ２３２３４１ｔｈｉｈｉｉｏｚｅｆ０．２ｉｄ．ｍｍ，
摘
要：从４个不同地区土样中共分离得到２０株天然无抗菌活性或抗菌活性微弱放线茵，采用链霉素
（ｔｐｏｙｉ）Ｓｅｔｃｎ、庆大霉素（ｅｔｍｃｎ及利福平（ｉｍｉｎ三重抗性法对其进行活性菌株的筛选后，ｌ株放线ｒｍＧｎａｙｉ）Ｒｆｐｃ）ａｉ７茵的发酵液显示了抑菌活性，其中ｌ号放线茵对链霉素、庆大霉素和利福平抗性分别为４、１和１０ｇｍ～００５・Ｌ，其发酵液对枯草芽孢杆菌ＡＣ６３Ｂｃｌｂｉｓ及藤黄微球菌ＡＣ３１Ｍｉｏｏｃｓｕｅｓ的抑茵圈直径分别ＴＣ６３（ａｉｕｓｔｉｌｓｕｌ）ＴＣ９４（ｃｃｃｕｔ）ｒｌｕ
ｏｈｉｍｅａｏｉｓｗＮｉｇｎ一ＷＡＧＸａｚｏ。ＺＡＧＪ，Ｈｈｏｉｇ，ｆｔｅｒｔｂｌｅ／ＡＧＸａｊｇｚ。Ｎｉｈｕ，ＨＮｉＺＵＺａｘｎ。ｔｎｉ，ｏ。ａ

放线菌筛选的一般方法

放线菌筛选的一般方法放线菌筛选是一种从大自然中寻找新的抗生素和其他有用化合物的方法。

放线菌是一类革兰氏阳性细菌，与其他细菌存在显著区别，它们具有许多生物活性代谢产物的天然合成能力。

因此，放线菌筛选被广泛应用于寻找新的抗生素和其他有活性的化合物。

1.采集样本：首先，需要在大自然环境中采集到放线菌的样本。

放线菌广泛分布于土壤、水体、植物等各种环境中，因此可以从这些环境中采集到样本用于筛选。

样本的采集可以通过在目标环境中收集土壤或其他样品，并将其置于合适的容器中保存。

2.预处理：采集到的样本通常含有大量不同种类的微生物，因此需要进行预处理步骤。

预处理的目的是去除其他微生物，只留下放线菌。

常用的预处理方法包括加热处理、酸碱处理、稀释等。

3. 筛选培养基的选择：放线菌的生长需要适宜的培养基，因此在筛选之前需要选择合适的培养基。

常用的培养基包括Mannitol-Soya agar （MSA）、Glycerol Yale agar（GYA）、Starch Casitone-Nitrate agar （SCN）等。

4.筛选培养条件的优化：放线菌的生长条件可以通过培养条件的优化来改善。

常用的优化参数包括温度、pH、培养时间和培养基成分等。

优化培养条件可以提高放线菌生长的速度和产生生物活性物质的能力。

5.放线菌分离：在筛选培养基上，可以观察到放线菌的集落。

这些集落可以单独分离，得到纯种的放线菌菌株。

分离放线菌的常用方法包括传代分离和扩散板法等。

6.放线菌菌株的筛选：得到纯种的放线菌菌株后，可以进行生物活性物质的筛选。

常用的筛选方法包括抗菌活性测定、抗肿瘤活性测定和酶活性测定等。

这些方法可以通过测量抑菌圈直径、细胞生存率和酶催化能力来评估放线菌菌株的活性。

7.活性物质的提取和纯化：经过筛选得到有活性的放线菌菌株后，还需要将其产生的活性物质进行提取和纯化。

常用的提取方法包括溶剂提取法、胶体微滤法和萃取法等。

而纯化方法则包括柱层析、薄层层析和高效液相层析等。

放线菌的分离与筛选方法

放线菌的分离与筛选方法放线菌（Actinomycetes）是一类革兰氏阳性细菌，常见于土壤和水体中。

由于其多样的形态和代谢特性，放线菌具有广泛的生物学和工业应用价值。

分离和筛选放线菌的方法是研究和利用其功能的基础，本文将介绍几种常用的方法。

一、分离方法：1.稀释和均匀涂布法：首先，将环境样品（如土壤、水样）进行适当稀释，并在培养基平板上平均涂布样品。

随着放线菌的生长，单个菌落会形成，然后可以通过挑选单个菌落进行分离纯化。

2.稀释和涂布法：方法类似于前者，但将初步培养得到的单菌落拖线在新的培养基平板上进行再次分离，以获得更纯的放线菌。

3.祛除污染菌法：样品前处理的关键是去除非放线菌细菌的干扰。

常见的处理方法有在分离培养基中加入抗生素、改变pH值等。

4.冷冻-融化法：利用放线菌对低温和高温的耐受性不同，将样品进行多次冻结-融化处理，可以选择性地分离出放线菌。

二、筛选方法：1.对抗菌活性筛选：放线菌具有对其他菌株的抗菌活性，可以使用对抗菌活性筛选方法，通过将待测分离物与感兴趣的致病菌共同培养，观察是否产生抑菌圈来筛选放线菌。

2.抗真菌筛选：放线菌不仅对细菌有抑制作用，也能抑制真菌的生长。

可以通过共培养放线菌和待测真菌，并观察是否产生抑菌圈来筛选放线菌。

3.溶磷筛选：放线菌具有溶解磷酸盐的能力，可以利用Na-P亚硝酸盐琼脂平板培养基来筛选放线菌。

4.产生生物活性化合物筛选：放线菌可以生成一系列生物活性化合物，如抗生素、酶、生物胺等。

可以根据需要设计相应的试剂盒，进行营养检测、酶活性测定或染色方法进行筛选。

5.双层平板筛选法：放线菌在液体培养基上生长一段时间后，将其转移到固体上层培养基上继续培养。

这种方法可以筛选出产生生物活性化合物的放线菌。

以上介绍的方法只是一小部分常用的放线菌分离和筛选方法，随着技术的不断发展，还有更多新的方法被提出。

分离和筛选放线菌是一个复杂且耗时的过程，需要根据具体的研究目的和条件来选择适合的方法。