荧光定量PCR中TaqMan荧光探针的原理及SYBR荧光染料的作用。
实时荧光pcr原理
实时荧光pcr原理实时荧光PCR原理。
实时荧光PCR（Real-time PCR）是一种能够在PCR过程中实时监测DNA扩增情况的技术。
它通过引入荧光探针或染料，实时检测PCR反应体系中的DNA量的变化，从而实现对PCR过程的实时监测和定量分析。
实时荧光PCR的原理主要包括以下几个方面：1. 荧光探针。
在实时荧光PCR中，常用的荧光探针包括TaqMan探针、Molecular Beacon探针和SYBR Green染料。
这些荧光探针在PCR过程中与靶标DNA结合，并产生荧光信号。
通过检测荧光信号的强度，可以实时监测PCR反应的进程。
2. 荧光信号检测。
实时荧光PCR系统配备了特殊的光学检测装置，能够实时监测PCR反应体系中荧光信号的强度变化。
当靶标DNA逐渐扩增，荧光信号也会随之增加。
通过检测荧光信号的变化，可以实时获取PCR反应的动态信息。
3. 数据分析。
实时荧光PCR系统通常配备了专门的数据分析软件，能够实时处理和分析检测到的荧光信号。
通过对荧光信号的定量分析，可以计算出PCR反应体系中靶标DNA的初始量，并绘制出PCR扩增曲线。
通过PCR扩增曲线的形态和特征，可以对靶标DNA进行定量分析和检测。
4. 应用领域。
实时荧光PCR技术在生命科学领域有着广泛的应用，包括基因表达分析、病原微生物检测、基因型分析等方面。
由于其高灵敏度、高特异性和高准确性，实时荧光PCR已成为现代分子生物学研究和临床诊断中不可或缺的技术手段。
总结。
实时荧光PCR技术通过引入荧光探针和光学检测装置，实现了对PCR反应的实时监测和定量分析。
它在生命科学领域有着广泛的应用前景，为基因分析、疾病诊断和药物研发等领域提供了强大的技术支持。
随着技术的不断进步和完善，实时荧光PCR技术必将在未来发挥更加重要的作用。
荧光定量PCR中TaqMan荧光探针的原理及SYBR荧光染料的作用。
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荧光定量PCR中TaqMan荧光探针的原理及SYBR荧光染料的作用。
2011-05-17 08:41
什么是TaqMan荧光探针和SYBR荧光染料？荧光定量PCR中TaqMan荧光探针的原理及SYBR荧光染料的作用。
TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
再通过实时监测整个PCR进程荧光信号的积累，与标准曲线对比进行定量分析。
SYBR荧光染料：在传统PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料能特异性地掺入DNA双链，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，这样就保证了荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
当PCR循环复制时DNA双链也成倍增长，同样SYBR 染料的荧光的信号也随之增倍，通过实时监测整个PCR进程中荧光信号的积累，与标准曲线对比进行定量分析。
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精品。
taqman探针工作原理
taqman探针工作原理
TaqMan探针是一种常用于实时荧光定量PCR的探针。
它的工作原理基于PCR过程中的DNA合成和降解。
TaqMan探针由两个部分组成：一个荧光染料（通常是荧光标记的探针）和一个质子酶（也称为引物）。
这两个部分之间有一个特殊设计的序列，被称为探针的引物序列。
在PCR反应中，当温度升高到合适的退火温度时，Taq DNA 聚合酶会开始合成新的DNA链。
同时，TaqMan探针的引物会与待测DNA序列上的目标区域特异性结合，并被Taq DNA 聚合酶所识别。
在DNA合成过程中，Taq DNA聚合酶会解读引物的序列，并在其5'端的3'端延伸时释放出荧光染料。
当荧光染料释放后，它的荧光信号将被检测仪器记录下来。
此时，PCR反应会不断进行，荧光信号会随着PCR循环的增加而累积。
通过监测荧光信号的强度和周期数，我们可以确定样品中待测DNA的起始量。
由于TaqMan探针的设计是特异性的，只有当引物与目标DNA序列完全匹配时，才会发生荧光信号的释放。
这使得TaqMan探针在实时PCR中具有高度的特异性和准确性。
总之，TaqMan探针通过监测PCR反应中荧光信号的释放来实现DNA定量，是一种可靠、灵敏且广泛应用于分子生物学研究的技术。
荧光定量PCR基础知识
内参-校准生物学误差
• 内参用于校准实验过程对定量结果的影响核酸提取时通常以重量或体积 为单位取样，再加上提取效率和操作误差，造成等量提取物不一定来源 于等量细胞（或基因组）
1. 用DNase酶处理样本 2. 检测no-RT对照（不进
行逆转录的样本）
+RT 和–RT 应该至少 相差6-7 Cts
(大约1% 信号由DNA 产生).
+RT -RT
4 阳性对照-监控系统故障
• 内参(管家基因) – 标准品线性范围 – 灵敏度 – 扩增效率
• 外源阳性内对照 – 来源PCR产物 – 质粒 – 阳性样本
3’端的前4个碱基不能有3个以上的G
避免重复序列：避免序列中4个以上的G或连续6个A
选择C比G多的链当探针
5‘端第一个碱基不能为G，如为FAM，则第二个碱 基 也 不 能 是 G。5" 端染料最好连接在T或C碱基上 。
Primer PCR产物大小建议50-150bp
Tm值:58-60℃ Primer长度： 20bp
RNA降解（小量等份分装）
两步法
• 先将RNA逆转录成cDNAs
• 将cDNAs 1:2 – 1:10 稀释
• 加入反应板中，实时扩增 cDNA，或-20º C储存（稳定保 存数周）
– 优势：cDNA远比RNA稳定， 可以反复冻融多次
– 不足：和一步法相比，需要更 多的加样步骤
预扩增
传统的基因表达分析
• 原始光谱视图（Raw Date ） : 显示PCR反应中荧光信号的软件视图 • 背景组分: 仪器基座的背景“噪音”。
背景噪音影响反应的灵敏度。 背景读数存储于计算机并被反应的荧光信号扣除
纯荧光校正
taqman探针原理
taqman探针原理TaqMan探针原理。
TaqMan探针是一种用于实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）的探针，它以其高度特异性和灵敏度而闻名。
在实时PCR中，TaqMan探针可以用来检测和定量特定DNA序列的存在，因此在分子生物学和遗传学研究中得到了广泛的应用。
TaqMan探针的原理基于PCR技术，PCR是一种能够扩增特定DNA片段的方法。
在PCR过程中，DNA片段会被不断复制，从而使得起始数量极少的DNA片段得以扩增至足够数量，以便进行后续的分析。
而TaqMan探针则在PCR的基础上，增加了一种荧光信号检测的方法，使得扩增过程可以实时监测和定量。
TaqMan探针由三部分组成，引物（primers）、探针（probe）和荧光染料。
引物是用于引导PCR反应的两个短的DNA片段，它们会结合到目标DNA序列的两端，并作为PCR反应的起始点。
探针是一段含有荧光标记和荧光信号猝灭子（quencher）的DNA片段，它设计为与目标DNA序列的中间部分互补。
在探针未被降解之前，荧光信号被猝灭子吸收，因此不会被探测到。
当PCR反应进行到一定程度时，引物会引导DNA聚合酶复制探针所在的DNA序列，当DNA聚合酶到达探针时，会降解探针，使得荧光信号被释放出来。
荧光信号的强度与PCR反应中目标DNA的数量成正比，因此可以用来实时监测PCR反应的进程。
TaqMan探针的设计需要考虑到多个因素，包括探针的长度、引物和探针的互补性、探针的荧光标记和猝灭子的选择等。
合理的探针设计可以提高PCR反应的特异性和灵敏度，因此在实际应用中需要进行严格的设计和验证。
总的来说，TaqMan探针原理是基于PCR技术的实时荧光定量PCR方法。
通过引物和探针的设计，以及荧光信号的监测，TaqMan探针可以实现对特定DNA序列的快速、特异性和定量检测。
在分子生物学研究、临床诊断和药物研发等领域，TaqMan探针都发挥着重要的作用，为科学研究和医学应用提供了强大的工具。
荧光PCR检测原理
实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。
其特点有:(1）用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测,避免终点定量的不准确性，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程.(2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。
Real-time O—PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。
实时荧光定量PCR技术的基本原理在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团,这些荧光物质有其特定的波长。
仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR 循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。
并且引入一个——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数,是在PCR 循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。
荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。
一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号,可以用于定义一个样本的Ct值。
通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。
方程式的斜度可以用来检查PCR的效率,所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数(R²＞0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量.实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量.实时荧光定量PCR技术的应用1. 基因工程研究领域①基因表达研究：对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行检测,其结果特异性强、定量准确，为了解β地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据.②转基因研究：利用两种发光探针及适当的循环阈值，扩增一个转移后的基因和一个对照基因,以分析转基因老鼠接合性。
荧光定量PCR中探针法与染料法的区别
荧光定量PCR中探针法与染料法的区别：一、荧光定量PCR中探针法与染料法的描述：1.荧光定量PCR探针法：探针法即除了引物外另外设置一个探针，在探针的两端分别带上发光集团和淬灭集团，这个时候，两个平衡不发光，但是当DNA 通过引物合成的时候，探针被折断，释放出发光集团和淬灭集团，两个距离较远，发光集团产生荧光，被机器收集到信号，从而检测基因的量2、荧光定量PCR SYBR Green 染料法：染料能够与双链结合，当PCR扩增的时候，染料结合到DNA上，从而发光，单个的染料不发光，这样就能收集到信号，我们可以看出，染料法特异性不强，只要是双链的DNA都回结合发光。
二、荧光定量PCR中探针法与染料法的优缺点1、探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，能够用多重体系反应的方法，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高2、染料法经济实惠，可以做溶解曲线，分析全部PCR产物的TM值，缺点就是特异性没有探针法好【分享】定量pcr仪选则宝典:各自精彩的选择如何选择合适的定量PCR仪定量PCR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统。
选择定量PCR仪的关键——由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。
至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流趋势——仪器的激发通道越多，仪器适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光，仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大。
荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。
激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源，前者可配多色滤光镜实现不同激发波长，而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长，不过因为是单色，需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。
染料法和探针法荧光定量PCR(RT-qPCR)的优缺点比较
染料法和探针法荧光定量PCR（RT-qPCR）的优缺点比较一、荧光染料法(SYBR Green)其原理是：在PCR反应体系中加入过量荧光染料，DNA扩增的过程中，荧光染料特异性地掺入DNA双链，发射荧光信号，随着反应的进行，荧光强度逐渐增强，并且可以实时测量。
如果你要扩增你的目标样品40个循环，在最后一个循环结束时检测到的荧光会比在第10个循环测得的荧光强很多。
优点：1、成本较低，适合大规模的实验。
2、在实验设计阶段非常省时，因为它只需要合适的引物设计。
缺点：1、特异性不是很高。
染料可以插入任何双链DNA，包括引物二聚物和非特异性产物。
2、如果引物二聚体存在或者产物受到污染，得到的结果会不可靠。
3、更容易与低丰度的目标产生非特异性荧光。
需要更多的时间进行结果分析。
二、寡核苷酸探针(Taqman)这种方法涉及使用荧光标记的寡核苷酸(短DNA分子)，探针通常在5 端和3 端都被标记。
在探针的5’端有报告基团，3’端设计淬灭基团，当报告基团接近淬灭基团时，不会检测到荧光信号。
RT-qPCR反应时，寡核苷酸两个基团分离，即可检测到荧光信号，并与PCR产物同步。
使用这种方法的荧光检测依赖于两个过程:1)引物与目标序列的结合(2)探针与引物下游互补序列的结合。
优点：1、更有可能只放大所需的产物，由于引物和探针的结合具有特异性。
2、不需要解离曲线，只有探针与正确的目的序列结合时才能检测到荧光。
3、由于具有特异性，数据更可靠。
4、数据分析时节省时间。
缺点：1、需要大规模实验时耗费成本高。
2、需要更长的时间来设计实验，因为需要好的引物和探针。
总的来说，这两种荧光检测方法都很有效，但对于你的具体实验，可以选择适合的方法。
荧光定量pcr检测taq酶活性
确保PCR反应体系的纯净度
避免引入污染物质，如DNA、RNA、蛋白质等， 以免干扰实验结果。
注意荧光染料和探针的特异性
选择与目的基因特异性结合的荧光染料和探针， 避免非特异性结合引起的ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ差。
ABCD
控制好实验条件
确保PCR反应过程中的温度和时间控制准确，以 保证扩增的特异性和效率。
标准化实验结果
使用已知浓度的DNA模板进行标准化，以便对 不同实验条件下目的基因的表达量进行比较。
Taq酶活性检测在荧光定量PCR实验 中具有重要的实际应用价值，尤其在 临床诊断、生物分析、基因表达分析 等领域。在这些领域中，准确可靠的 实验结果对于疾病诊断、药物研发和 生物科学研究具有重要意义。
Taq酶活性检测的意义
荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、 高特异性的核酸定量检测方法，而 Taq酶是荧光定量PCR反应中的关键 酶，其活性直接影响PCR反应的效率 和准确性。因此，检测Taq酶活性对 于荧光定量PCR实验的成败至关重要 。
实验注意事项
确保PCR反应体系的纯净度
避免引入污染物质，如DNA、RNA、蛋白质等， 以免干扰实验结果。
注意荧光染料和探针的特异性
选择与目的基因特异性结合的荧光染料和探针， 避免非特异性结合引起的误差。
ABCD
控制好实验条件
确保PCR反应过程中的温度和时间控制准确，以 保证扩增的特异性和效率。
标准化实验结果
结合，形成荧光标记的引物。
PCR扩增
04 在含有荧光标记引物的反应体
系中，进行PCR扩增反应。
实时监测
05 在PCR扩增过程中，通过实时
监测荧光信号的强度，记录数 据并进行分析。
结果分析
QPCR定量简介
荧光定量PCR一、原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。
原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
优点：重复性好，特异性高，灵敏性高，可多重PCR；缺点：只适合特定目标，价格较贵，本底信号较高。
2）SYBR荧光染料：SYBR荧光染料是一种可以结合在DNA双螺旋小沟区域具有绿色激发波长的燃料。
在PCR 反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
优点：引物设计方便，价格优势；缺点：特异性差，引物要求高，灵敏度差，不能进行多重定量。
二、内标在传统定量中的意义1．几种传统定量PCR方法简介：1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。
上游引物用荧光标记，下游引物不标记。
在模板扩增的同时，内标也被扩增。
在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。
在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。
实时荧光定量PCR原理及应用
实时荧光定量PCR原理及应用一、原理：1.荧光探针原理：a. TaqMan探针：TaqMan探针是由小分子荧光染料和一个捕获目标序列的DNA探针构成。
在PCR过程中，TaqMan探针会结合到特定的目标序列上，当DNA聚合酶在PCR反应中扩增特定序列时，探针被加性外切酶活性所降解，导致荧光信号逐渐降低，通过荧光信号的减弱来量化目标DNA的数量。
b. SYBR Green探针：SYBR Green探针是一种可以与双链DNA特异性结合的染料，当SYBR Green与PCR产物结合时，荧光信号增加。
通过测量荧光信号的增加来量化目标DNA的数量。
c. Molecular Beacons：Molecular Beacons是由在末端带有荧光分子和淬灭荧光的猝灭体构成的。
在PCR过程中，当Molecular Beacons与目标序列匹配时，荧光信号释放，通过测量荧光信号的释放来量化目标DNA的数量。
2.PCR反应原理：a.变性：将含有目标DNA序列的模板DNA样品与引物和荧光探针混合，加热至高温，使DNA双链解除成两股单链DNA。
b.引物结合：将反应体温度降低，引物结合到目标DNA序列的特定区域，并与模板DNA进行互补组装。
c.扩增：在DNA聚合酶的作用下，引物在模板上逐渐沿着DNA链延伸，产生新的DNA片段。
每一轮PCR循环结束后，荧光信号会相应地增加。
二、应用：1.目标基因表达分析：可以用实时荧光定量PCR测定特定目标基因的表达水平，从而研究基因的功能、调控机制或者生理功能的变化。
2.病原体检测：实时荧光定量PCR可以检测和定量各种病原体，例如病毒、细菌、真菌等。
常见的应用包括检测呼吸道病原体、性传播疾病病原体、食物中污染的细菌等。
3.肿瘤检测：实时荧光定量PCR可以用于肿瘤相关标志物的检测，帮助早期筛查和诊断肿瘤。
4.遗传突变检测：可以通过实时荧光定量PCR检测人类基因中的突变位点，提供遗传病检测和个体基因组分析的支持。
三种荧光定量PCR检测方法比较
三种荧光定量PCR检测方法比较定量pcr：以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本中靶基因的拷贝数,称为定量PCR。
定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。
常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类：<1> SYBR Green I 检测模式SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。
其与双链DNA 结合后, 荧光大大增强。
因此, SYBR Green I 的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关,可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量。
SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm。
PCR 扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法,40 个循环。
SYBR Green I 的缺点：由于SYBR Green I 没有特异性,不能识别特定的双链,只要是双链就会结合发光,对PCR 反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光,通常本底较高,所以在临床上使用可能会有假阳性发生。
SYBR Green I 的优点：SYBR Green I 的优点是因为其缺点产生,由于它能所有的双链DNA相结合,所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针,通用性较好,并且价格相对较低。
这对科研是很有利的,因此国内外在科研中使用比较普遍。
<2> 水解探针模式<taq man探针>TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5’末端, 而淬灭剂则在3’末端。
当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。
在进行延伸反应时,聚合酶的5’外切酶活性将探针切断,使得荧光基团与淬灭剂分离,发射荧光。
一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。
随着扩增循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累。
因此Taqman 探针检测的是积累荧光。
PCR 扩增程序通常是：94℃～60 ℃40 个循环。
qRT-PCR原理与应用
引物质量评价：评价“高效+特异”
软件打分
PCR验证
qPCR扩增曲线+融解曲线
定量检测
程序设置与普通PCR无异，但产物长度较小，可使用两步法（退火延伸 qPCR程序 同时完成）替代三步法，同时需要增加荧光采样点。
也可以使用一步法qRT-PCR：使用目标序列特异性引物，同时完成逆 转录与定量。
荧光值到模板量
结果与图片
数据分析
绝对定量-标准曲线
标准品 梯度稀释
PCR-Ct扩增曲线
模板浓度 C0-Ct标曲
结果图片展示
扩增与融解曲线
相对定量-ΔΔCt法 内参基因 扩增曲线 Δ数学关系
表达量柱状图
mRNA/Lnc
miR特异性序列+茎环结构，每 个目标序列需要逆转录一次
利用ploy A
随机引物
添加ploy A
一步到位，无特异性逆转录全部RNA为cDNA
miR
茎环法
5’-端引物在逆转 录与qPCR间通用， 3’-端随机
模板质量评价
电泳
光度
梯度模板下qPCR扩增曲线
引物设计与检验
qPCR引物设计原则
原理 qRT-PCR
从PCR到qPCR
qPCR原理
荧光标记 Ct值
Taqman探针：探针两端分别接荧光基团 与荧光淬灭基团,PCR中Taq酶切开探针，
分离荧光基团，使之荧光不被淬灭
染料荧光：SYBR染料，结合DNA双螺旋大 沟发荧光，与单链不结合
扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数 （Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。简单讲，Ct值
罗氏荧光定量pcr
罗氏荧光定量 PCR 是一种高灵敏度、高精确度的多重荧光定量 PCR 技术，可以用于定量检测 DNA 或 RNA 中的特定序列。
该技术不仅可以用于基础研究，还可以应用于临床诊断和药物研发等领域。
一、基本原理罗氏荧光定量 PCR 基于 PCR 扩增技术，在 PCR 反应过程中，使用荧光标记的探针来定量检测扩增产物的数量。
该技术采用两个荧光染料：SYBR Green 和 TaqMan 探针。
SYBR Green 是一种结合双链 DNA 的荧光染料，可以在 PCR 反应过程中不断累积，并发出荧光信号；而 TaqMan 探针是一种在 PCR 反应过程中被水解释放的荧光探针，可以在特异性结合目标序列后发出荧光信号。
通过测量这些荧光信号的强度，可以确定 PCR 反应产物的数量。
二、实验步骤1. 样品制备首先需要从样品中提取出目标 DNA 或 RNA，常用的提取方法包括酚-氯仿提取法、磁珠法等。
提取后需要进行纯化和定量，确保样品质量和浓度符合要求。
2. PCR 反应将样品DNA 或RNA 与特异性引物、荧光探针和PCR Master Mix 混合，加入 PCR 反应管中，进行 PCR 扩增反应。
PCR 扩增条件需根据具体引物和模板 DNA/RNA 来确定，一般包括以下步骤：(1) 热变性：将反应体系加热至 95℃，使 DNA/RNA 双链分离为单链。
(2) 退火：将反应体系降温至引物的退火温度，使引物与模板DNA/RNA 特异性结合。
(3) 延伸：利用DNA/RNA 聚合酶将引物延伸，合成新的DNA 单链。
(4) 荧光检测：在延伸过程中，荧光探针与目标序列特异性结合，发出荧光信号。
荧光信号的强度与产物数量成正比，可以通过检测荧光信号来定量 PCR 扩增产物。
3. 数据分析利用荧光数据分析软件对荧光信号进行分析，得出 PCR 扩增产物的数量。
根据标准曲线，可以将荧光信号转化为目标序列的数量，从而定量检测样品中的目标 DNA 或 RNA。
实时荧光定量PCR-TaqMan探针法及设计原则
03
Taqman探针的合成与制备
探针的合成方法
化学合成法
通过化学反应将荧光基团和淬灭基团分别连接到DNA或RNA的5'和3'末端，形成 Taqman探针。
酶促合成法
利用DNA聚合酶将荧光基团和淬灭基团分别添加到DNA或RNA的特定位置，形成 Taqman探针。
探针的质量检测与纯化
质量检测
通过电泳、质谱和光谱分析等方法检测探针 的长度、荧光基团和淬灭基团的数量和位置 ，以及探针的纯度。
定义与原理
定义
实时荧光定量PCR-Taqman探针法是 一种基于荧光信号的实时监测技术， 用于定量分析DNA或RNA的拷贝数。
原理
通过在Taq酶催化下，利用荧光染料 标记的特异性探针与待测核酸进行特 异性结合，在PCR循环过程中实时监 测荧光信号的增强，从而实现对核酸 的定量分析。
发展历程与现状
02
Taqman探针的设计原则
探针的长度与结构
长度
通常为20-30bp，确保特异性并减少非特异性扩增。
结构
由报告基团、淬灭基团和连接臂组成，连接臂长度一般为5-6个脱氧核糖核苷酸。
探针的特异性
针对目标序列
确保探针与目标序列完全匹配，避免 交叉反应。
序列选择
选择基因特异性区域，避免基因组中 的高变区。
04
Taqman探针在实时荧光定量 PCR中的应用
样本处理与PCR反应体系建立
样本处理
确保样本质量，去除杂质和抑制剂，提 取高质量的DNA或RNA。
Taqman探针设计
根据目标基因序列设计Taqman探针， 确保探针的特异性和荧光信号的稳定
性。
引物设计
根据目标基因序列设计特异性引物， 确保引物与模板的结合效率和特异性。
Real-time Quantity PCR
qPCR 试剂盒 1.一步法 一步法 (1)优化于 优化于ABI系统 优化于 系统 ① SuperScript Ⅲ Platinum one-step qRT-PCR Kit w/ROX ② SuperScript Ⅲ Platinum SYBR Green one-step qRT-PCR Kit w/ROX (2)适用于其他系统 适用于其他系统 ① Superscript Ⅲ Platinum one-step qRT-PCR Kit ② SuperScript Ⅲ Platinum SYBR Green one-step qRT-PCR Kit
(3)RNA UltraSense One-step Quantitative RT- PCR System 适用于超低量RNA摸板的灵敏扩增的 适用于超低量 摸板的灵敏扩增的 QRT-PCR系统 系统 (4)Platinum qRT-PCR Thermoscript One-step System 适用于扩增具有二级结构的RNA 适用于扩增具有二级结构的 2.二步法 二步法 (1)优化于 优化于ABI系统 优化于 系统 ① SuperScript Ⅲ Platinum two-step qRT-PCR Kit w/ROX ② SuperScript Ⅲ Platinum SYBR Green two-step qRT-PCR Kit w/ROX
Invitrogen qPCR产品 产品 (1) superscript RT 和更好的特异性。 和更好的特异性。 可获得更高的cDNA产量 产量 可获得更高的
(2) Platinum Taq DNA Polymerse为PCR反应 为 反应 提供更高的特异性和产量。 提供更高的特异性和产量。 (3) Supermixes 包括了 包括了Platinum Taq DNA 聚 合酶和UDG及dNTPs，ROX参照染料。 参照染料。 合酶和 及 ， 参照染料 (4) SYBR Green Ⅰ 及LUX引物 引物
荧光定量PCR
荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，简称qPCR）是一种分子生物学技术，用于精确测定样本中特定核酸序列的数量。
其基本原理基于PCR（聚合酶链式反应）技术和实时荧光检测，能够在PCR扩增过程中连续监测荧光信号的变化，从而实现对起始模板量的定量分析。
荧光定量PCR原理简述：1.PCR扩增：qPCR采用传统的PCR方法，包括变性（DNA双链解开成单链）、退火（引物与靶序列配对）和延伸（DNA聚合酶合成新链）这三个基本步骤，反复进行使得目标序列指数级扩增。
2.荧光标记与检测：SYBR Green法：SYBR Green是一种非特异性的双链DNA结合染料，在游离状态下几乎不发出荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光强度显著增强。
因此，随着PCR过程中的产物增加，荧光信号也相应增加，荧光强度与PCR产物的数量成正比。
TaqMan探针法：此方法更为特异，使用一种特殊的寡核苷酸探针，其两端分别标记了荧光报告基团和淬灭基团。
在PCR反应中，当探针与靶序列配对时，位于中间的探针被Taq 酶水解，导致荧光报告基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。
只有当特定的扩增产物生成时才会释放荧光。
荧光定量PCR实验步骤概览：1.样品制备：RNA提取：从组织、细胞或其他生物样本中提取总RNA，常用TRIZOL或类似试剂进行裂解、离心分相和乙醇沉淀来纯化RNA。
cDNA合成：对于mRNA的定量，需要先将RNA逆转录为cDNA。
2.设计与合成引物：针对目标基因设计一对特异性的PCR引物，用于扩增目的片段。
3.PCR反应体系构建：将纯化的cDNA或DNA模板、特异性引物、Taq聚合酶、缓冲液、dNTPs和其他必要成分如SYBR Green染料或TaqMan探针等加入至PCR管中，配置成最终的PCR反应体系。
4.实时荧光PCR扩增与检测：在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，仪器在每次循环的适当阶段收集荧光信号，并记录下来。
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矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。