转录组的研究技术方法及当前

（2）转录组测序确定RNA结构 2010年12月份美国加州大学圣克鲁兹分校霍华德· 休斯 医学研究院Sofie Salama教授所领导的课题组描述了一 种通过转录组高通量测序方法测定RNA结构的方法 (Fragmentation sequencing ，FragSeq)，该方法发 表在《自然—方法学》。该方法利用核酸酶P1只切割 单链RNA的特性对小鼠RNA进行片段化，片段化RNA 的大小在20–100nt之间，然后在片段的5’和3’端分别加 上测序接头，再进行逆转录和PCR扩增，最后构建 FragSeq文库并对其进行高通量测序。同时作者通过生 物信息学分析大量的高通量测序结果，并辅以实验数据 成功测定了小鼠的非编码RNA的二级结构。

(4)更广的检测范围：高于 6 个数量级的动 态检测范 围, 能够同时鉴定和定量稀有转录本和正 常转录本; 而芯片对过低或过高表达的基因缺乏敏 感性, 因而动 态检测范围小。此外, RNA-Seq 重复 性好, 无需技术 重复, 而且起始样品比芯片技 术要少得多, 尤其适用 于来源极为有限的生物样品 分析, 如癌症干细胞。
RNA-seq技术的缺陷
测序技术 的 改进和测序费用的高； 生物信息学分析软件的开发不彻底，测序虽然得到 了大量的数据, 但基于有限的生物信息学分析软件, 经常导致人们所对要分析的东西不能得到很好的结 果 , 造成测序数据的浪 费 ； 平台测序长度不够大，目前虽然发展起来的 454 FLX 测序平台测序长度能达到700hp以上, 但测序费 用的昂贵使得许多科研工作者望而却步
转录组的研究技术方法及当前进展
郑忠巧 生物工程一班 20114129
什么是转录组？

广义转录组（Transcriptome）系指从一种细胞或者 组织的基因组所转录出来的RNA的总和，包括编码 蛋白质的mRNA和各种非编码RNA（rRNA, tRNA, snoRNA, snRNA,microRNA 和其他非编码RNA 等）。狭义转录组系指所有参与翻译蛋白质的 mRNA 总和。
(3)MPSS法的特点

MPSS是SAGE的改进版，MPSS 技术首先是提取实 验样品RNA并反转录为cDNA，接着将获得的cDNA 克隆至具有各种adaptor 的载体库中，并PCR 扩增 克隆至载体库中 的不同cDNA 片段，然后在 T4 DNA 聚合酶和dGTP 的作用下将PCR产物转换 为单链文库，最后通过杂交将其结合在带有Antiadaptor 的微载体上进行测序。MPSS 技术对于功 能基因组研究非常有效，能在短时间内捕获细胞或 组织内全部基因的表达特征。MPSS技术对于鉴定致 病基因并揭示该基因在疾病中的作用机制等发挥了 重要作用

（2）SAGE法的特点

SAGE是以Sanger测序为基础用来分析基因群体表 达状态的一项技术。SAGE 技术首先是提取实验样 品中RNA并反转录成cDNA，随后用锚定酶 (Anchoring enzyme)切割双链cDNA，接着将切割 的cDNA 片段与不同的接头连接，通过标签酶酶切 处理并获得得到SAGE 标签，然后PCR 扩增连接 SAGE 标签形成的标签二聚体，最后通过锚定酶切 除接头序列，以形成标签二聚体的多聚体并对其测 序. SAGE可以在组织和细胞中定量分析相关基因表 达水平。在差异表达谱的研究中，SAGE可以获得完 整的转录组学图谱以及发现新的基因并鉴定其功能、 作用机制和通路等。

（3）转录组测序在疾病方面的应用 转录组测序 (RNA-seq) 是最近发展起来的利用高通量 测序技术进行转录组分析的一种技术, 可全面快速地获 得特定细胞或组织在某一状态下的几乎所有的成熟 mRNA和ncRNA。相对于传统的基因芯片技术， RNA-seq技术不需要针对已知序列设计探针，即可检 测细胞或组织的整体转录水平。RNA-seq技术具有更 灵敏的数字化信号更高的通量以及更广泛的检测范围。 在疾病的机制研究以及疾病治疗领域，转录组测序作 为一个有力的工具已经被广泛使用。
为什么研究转录组？

转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质 组的纽带，转录水平的调控是最重要也是目前研究 最广泛的生物体调控方式。转录组的研究比基因组 的研究能给出 更高效的有用信息。比如，人类基因 组包含有30亿个碱基对，其中大约只有5万个基因转 录成mRNA分子，而转录后的mRNA仅部分被翻译 生成功能性的蛋白 质。与基因组不同，转录组更有 时间空间性。比如， 我们人体大部分细胞具有一模 一样的基因， 而即使同一细胞在不同的生长时期及 生长环境下，其基因表达情况也是不完全相同的。 所以，除了异常的mRNA降解现象（如转录衰减） 以外，转录组反映的是特 定条件下活跃表达的基 因。
小结：
转录组是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态 下转录出来的所有 RNA 的集合。转录组研究能够从整 体水平研究基因功能以及基因结构, 揭示特定生物学过 程以及疾病发生过程中的分子机理。RNA-Seq 作为 一 种新的高效、快捷的转录组研究手段正在改变着人们 对转录组的认识。RNA-Seq 利用高通量测序技术对组 织 或细胞中所有RNA反转录而成的cDNA文库进行测 序, 通过统计相关读段(reads)数计算出不同RNA的表 达量, 发现新的转录本; 如果有基因组参考序列, 可以把 转录本映射回基因组, 确定转录本位置、剪切情况等更 为全 面的遗传信息, 已广泛应用于生物学研究、医学研 究、临床研究和药物研发等。对于转录组的研究未来 将更加深入。
转录组的各个研究方法的特点
（1）基于杂交技术的特点 基于杂交技术的DNA芯片技术只适用于检测已知序 列，却无法捕获新的mRNA。细胞中mRNA的表达 丰度不尽相同，通常细胞中约有不到100种的高丰度 mRNA，其总量占总mRNA一半左右，另一半 mRNA由种类繁多的低丰度mRNA组成。因此由于 杂交技术灵敏度有限，对于低丰度的mRNA，微阵 列技术难以检测，也无法捕获到目的基因mRNA表 达水平的微小变化
来自百度文库
RNA-seq的特点及应用

二代测序在转录组的研究上越来越普 遍, 大有替代先 前的基因芯片(microarrays)和基因表 达系列分析技 术(serial analysis of gene expression, SAGE)之趋 势。由于测序深度的优势, RNA-seq更 能全面地揭示 生物个体在特定时刻和特定组织的全 局基因表达情 况, 如发现新的转录本、了解基 因表达量、挖掘单核 苷酸的多态(single-nucleotide polymorphisms, SNPs)、选择性剪接(alternative splicing)和结构性 变异(structural variation)。对于 序列信息有限的 非模式生物, RNA-seq更偏重编码 区域。由于相比于 基因组, 重复元件和高GC区比较 少, 使得拼接相对容 易, 所以转录组研究在许多非模 式植物中得到了广泛 应用。
转录组前沿的一些研究
（1）单细胞转录组的分析 转录组分析应该以单细胞为研究模型，科学家应用单细胞 RNA-seq技术即可获得单细胞的转录组信息。2009年 Surali Azim和 Lao Kaiqin领导的课题组通过对单个小鼠卵 裂球细胞的RNA- Seq数据进行分析，分析发现至少5个测 序所获得的reads比微阵列技术多出75％（5270）的表达基 因，并鉴定了1753个崭新的剪切位点。除此以外，单细胞 的RNA-seq结果表明了在相同的卵裂球或卵母细胞中，至 少有8-19％的基因存在两个以上的转录异构体，该现象清楚 表明了在胚胎发育过程中单细胞转录组的复杂性。最后，通 过对单个Dicer1-/- 和 Ago2-/-卵母细胞的转录组测序，相对 野生型来说，Dicer1-/- 和 Ago2-/-卵母细胞分别发现1696和 1553个基因异常上调，1571和1121个基因异常下调，而 619基因是相同的。这种单细胞RNA-Seq技术检测将大大提 高我们对单个细胞在哺乳动物发育中转录复杂性的理解。
RNA-seq技术的优势

(1)数字化信号：直接测定每个转录本片段序列, 单核 苷酸分辨率的精确度, 可以检测单个碱基差 异、基因 家族中相似基因以及可变剪接造成的不同 转录本的 表达, 同时不存在传统微阵列杂交的荧 光模拟信号带 来的交叉反应和背景噪音问题, 能覆 盖信号超高的动 态变化范围。(2)高灵敏度：能够检 测到细胞中少至 几个拷贝的稀有转录本。(3)任意物 种的全基因组分 析：无需预先设计特异性探针, 因 此无需了解物种基 因信息, 能够直接对任何物种进 行转录组分析, 这对 非模式生物的研究尤为重要, 例如 Wang 等、Xiang 等 和 Vera 等利用 RNA-Seq 技术分别对白粉虱、海 鲈鱼和蝴蝶转录组 进行了研究。同时能够检测未知 基因, 发现新的转 录本, 并精确地识别可变剪切位点 及 cSNP, UTR 区域。
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研究转录组的基本方法

目前研究转录组的方法主要有:（1）基于杂交技术， 如cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片；（2）基于测序技 术，如早先给予Sanger测序的SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)和MPSS(Massively Parallel Signature Sequencing),全长cDNA文库和 EST文库的测序分析.现在对cDNA、EST等的测序 工作已升级为代测序技术，第一代测序技术较 Sanger测序技术通量更高，运行时间更短，测序片 段更长；（3）基于新一代高通量测序技术的转录组 测序，现在通常将基于第二代测序技术的转录组测 序分析称为RNA-Seq。
(4）高通量测序技术的特点
SAGE及MPSS技术的低通量模式切换至RNA-seq的高 通量模式。作为蛋白质组研究的基础，RNA-seq可以 识别比蛋白组高一两个数量级的基因，从而帮助科学 家构建完整的基因表达谱以及蛋白质相互作用网络。 RNA-seq对于真核生物的基因表达调控，癌症等疾病 的发生机制和新治疗方案确定，遗传育种等方面的研 究具有不可估量的潜力。

对RNA-seq未来的展望

虽然 R N A 一seq 技 术还面临着种种困难, 相信随着 相关学科的进一步 发展和测序成本的进一步降低, R N A 一seq 必将为基 因的研究提供强有力的手段 , 并 在转录组学研究领 域占据主导地位 ―也相信随着测序 技术的不断进步 , 人们能够对转录组开展更为深人的 测序工作, 能够 发现更多 、更可靠 、更有用的转录 本。


2010 年7 月, 密歇根大学Arul MChinnaiyan实验室 分析了15 例前列腺癌样本的转录组测序结果, 研究发 现其中有两例前列腺癌样本的ETS基因没有发生融 合，进一步的研究表明存在于Raf信号途径中的 BRAF和RAF1基因会发生融合现象，作者同时利用 q-PCR和FISH技术验证了上述现象的存在。除此以 外，作者通过对大批不同的癌症样本进行荧光原位 杂交实验，并精确统计了BRAF和RAF1基因的重排 频率，统计结果表明了各种癌症样本如胃癌，肝癌， 黑色素瘤和前列腺癌的研究结果具有高度的一致性。 此项成果证明了RAF信号途径在一系列癌症如前列 腺癌、胃癌和黑色素瘤发病过程中起到了非常重要 的角色, 同时研究成果也表明了RAF信号途径中的融 合基因有潜力成为抗肿瘤治疗与抗肿瘤药物筛选的 靶标。