免疫组化操作方法简介PPT课件

Polymer原理图
PV-9000
Ki-67
CK
PR
CD56
写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
The foundation of success lies in good habits
33
谢谢聆听
·学习就是为了达到一定目的而努力去干, 是为一个目标去 战胜各种困难的过程,这个过程会充满压力、痛苦和挫折
2min×3次 5. 滴加适当量的检测系统，37℃孵育15－30分钟 6. PBS冲洗， 2min×3次 7. DAB显色剂显色 8. 自来水充分冲洗，苏木素复染，脱水透明（如需要）、封
片
组织的前期处理
➢ 组织固定 ➢ 烤片
固定时间对染色的影响
固定比较：Vimentin （V-9）
中性福尔马林固定 72小时
中性福尔马林固定 48小时
➢ 固定时间较长的标本，可通过加强修复
增强染色效果
➢ 取材后组织（1.0×1.4×0.4cm）推 荐后固定时间4-18小时
HIER: pH & time Ki67 MIB1
Tonsil Fix. 4 h.
Ci pH 6 10Min
Ci pH 6 30Min
TE pH 9 10Min
CgA多克隆与兔单抗比较
单克隆抗体 Chromogranin A
多克隆抗体 Chromogranin A
针对不同组织选择不同的二抗
➢ 对于肝脏、肾脏பைடு நூலகம்生物素含量高的标 本一定要选择非生物素的检测系统
➢ 酶标二抗可以有效避免生物素的干 扰并提高敏感性
内源性生物素
Polymer原理图
PV-6000
➢ D 下降型抗体：适用于酸性修复液
抗原修复
Calponin: 用不同pH值修复液的实验结果
抗原热修复方式的推荐
➢ 高压修复：
将修复液烧开后将切片放入高压锅中，然后 盖好盖子，加上气压阀，继续加热。待喷汽后开 始计时2.5分钟后停止加热，自然冷却。
➢ 微波修复：
将切片放入修复液中，然后将修复液烧开， 此时降低火力持续20分钟。然后自然冷却。
免疫组化基本操作
小新
免疫组化实验基本原理
SP原理
免疫组化实验操作步骤
1. 切片脱蜡至蒸馏水或PBS 2. PBS冲洗2min×3次，（如需抗原修复，可在此步后进） 3. 3%H2O2室温孵育10分钟。蒸馏水冲洗，PBS冲洗2min×3 4. 滴加一抗工作液，37℃孵育1.5~2h或4℃过夜。PBS冲洗，
抗原修复的主要方法
抗原热修复的主要影响因素：
➢ 温度和时间的相关性 ➢ 修复液的pH值亦很重要
抗原热修复温度和时间的关系
MBI单克隆抗体免疫组化灵敏度实验
时间
(分钟)
5× 2
5× 6
5×10
10小时
100°C +++ ++++ -
80°C
-
+++ ++++
-
60°C +++
抗原热修复的有效性 =加热温度（T）× 加热时间（t）
Tonsil Fix. 168 h.
烤片的影响因素
二个主要因素：
➢ 烤片的温度不宜过高 ➢ 烤片的时间不宜过长
烤片的影响因素
➢ 烤片的温度和时间对组织内抗原 的保存有一定的影响，尤其是细 胞核阳性的抗原
➢ 推荐烤片温度及时间68-70℃烤2-4 小时
实验中需要注意的问题
关键步骤：
➢ 抗原方式的选择及操作方法 ➢ 一抗的选择及稀释比 ➢ 检测系统的恰当匹配
选择最佳修复方式
➢ 不修复 ➢ 热修复 ：微波、高压、水浴 ➢ 酶消化：胃酶、胰酶、蛋白酶K、
XXV酶 ➢ 双暴露：先热处理后酶消化or先酶
消化后热处理
一抗的选择
➢ 正确的克隆号
➢ 适当的稀释度 ➢ 推荐4℃过夜，可以选择室温1.5－2h 或37 ℃1h
检测系统的选择
➢ 针对不同的组织选择不同的二抗 ➢ 两步法原理
➢ 高温可以缩短修复时间 ➢ 低温需要更长的修复时间 ➢ 某些蛋白（抗原）需要较低温度修复
微波炉修复和高压锅修复的比较
温度 微波炉 100°C 高压锅 120°C
压力 时间 受热 1P 15~20分钟 不均匀 1.2P 喷气2分钟 均 匀
不同修复方式CD20的染色结果
单克隆抗体 CD20 高压锅修复
Learning Is To Achieve A Certain Goal And Work Hard, Is A Process To Overcome Various Difficulties For A Goal
单克隆抗体 CD20 微波修复
抗原热修复:pH值的影响
A：CD20 B：Ki-67 C：HMB45 D: MOC31
pH6
pH8-9
四种类型的抗体
➢ A 稳定型抗体：pH值改变对实验结 果影响不大
➢ B “V”型抗体：强酸强碱修复液效 果好，但强酸条件下，细胞皱缩 变形，影响观察
➢ C 上升型抗体：修复液pH值越高， 效果越好