生物传感器-5

2)蛋白质吸附在电极表面以后,分子部分变性;
3)不合适的空间取向.
8.2原理与特点
1)不需要氧分子,不需要介体,不需要固定化载体，酶直接吸
附固定在电极表面, 与电极直接“交流”，电子传递快，电极响
应速度更快、灵敏度更高，成为真正“无试剂分析” 2)酶与电极直接电子传递，降低了系统非特异性反应倾向
8.3进行直接电化学反应的酶和蛋白质
蛋白质在金属或是没有处理的电极上电子转移非常慢,但是在用表面活性剂处理后 的电极上展现很好的电子转移能力.
8.3.9双功能亚铁血红素-酶类
许多天然氧化还原酶含有两个氧化还原活性中心,属于非蛋白
基团(prosthetic group),它们构成蛋白质的电子转移通道.这类酶 是唯一一类可以进行研究外源电子传递和内部电子传递及其调控 的酶类. 纤维二糖脱氢酶(cellobiose dehydrogenase, CDH)就是一例.
图8-6 假单胞菌细胞色素P450的三维结构
细胞色素P450能与氧直接反应,将电子传递给氧,因此是一种 终末氧化酶,其反应机理如下:
Fe(III)[R-H] + e Fe(II)[R-H] (R-H为酶蛋白-血红素)
Fe(II)[R-H] + O2
Fe(III)[R-H]O2-[R-H] + H2O
过氧化物酶的催化过程如下:
POD + H2O2
Cpd I + S
Cpd I + H2O
Cpd II + S˙
Cpd II + S + 2H+
POD + S˙+ H2O
POD是铁酶,Cpd I 和 Cpd II分别是POD的氧化中间体I和氧化
中间体II;S和S˙分别为电子供体(donor)和其氧化产物.如果酶被固
脂肪酸单加氧酶细胞色素P450是一种多域结构:二黄素(FDA/FMN)氧化酶 域和血红素域，是一种比较理想的研究电子传递的分子模型．当固定于电极 表面时可以获得循环伏安电流峰，这是黄素还原酶域和Fe3+/Fe2+氧化还原对
共同起作用的结果.蛋白质在电极表面固定后,还原酶的峰逐渐消失而血红素的
峰逐渐增强,但是在溶液中由于蛋白质在修饰电极表面的重新组装和更新电极 而使峰能维持长时间不变.
线到氧化还原中心将能促进电子传递.
8.3.7血红蛋白(hemogbobin,Hb)
血红蛋白的相对分子质量为65000,四聚体,含有两个亚基和
两个亚基,每个亚基含有一个亚铁血红素,分开的亚基没有功能. 在胎儿时期,细胞表达亚基而不表达亚基.出生之后, 亚基取 代亚基.Hb存在于红细胞中,在高氧分压环境(如肺部)摄取氧分 子,而后在低氧分压环境中释放氧,提供给组织和细胞,以维持细
8.3.2 氧化还原酶的电子传递
氧化还原酶和蛋白质的氧化还原中心主要含有三种基团：亚 铁血红素(heme)、铁至硫族和铜。实现直接电化学反应，要求 酶的氧化还原中心不被屏蔽，并提供比较高的工作电位。一般 认为，酶与电极进行直接电化学反应的基本条件是酶的催化活 性部位与电极靠近(<2nm)。目前所研究的大多数酶类不适于用 直接电化学反应。
Fe(V)=O[R-H] + H2O
Fe(III)[R-H]O2-[R-H] + e + 2H+ Fe(V)=O[R-H] Fe(III)R-OH
在细胞内,细胞色素P450参与催化多种反应,如毒物和药物 代谢,还可以在体外直接氧化多种化合物和农药,如四氯化碳、二 甲基苯、溴苯、乐果、对硫磷、马拉硫磷等。其反应归纳起来 包括：环氧化作用、N-脱烷基作用、O-脱烷基作用、S-氧化作 用和羟化作用等。最典型的催化反应如下： NADPH + H+ + O2 + RH NADP+ + H2O + R-OH
血红蛋白色素部分，由铁原子及原卟啉区组成.
图8-3 亚铁血红素分子
8.3.4细胞色素C
细胞色素C(cytochrome,C)是一种古老的蛋白,在生命进化早
期就存在.它在细胞能量产生过程中发挥关键的作用,其分子进化 比较保守.从酵母到植物,甚至人体细胞,其组成结构都很相似. Cyt C是一种含亚铁血红素的氧化还原蛋白,存在于细胞线粒 体中,在呼吸链的电子传递中起重要的作用. 亚铁血红素通过硫醚键与Cyt C的半胱氨酸结合,并部分地暴 露在溶液/电极表面,其氧化还原过程能够给出强的电化学信号和
过氧化物酶-亚铁血红素
-700
-600
-500
-400
-300 -200 -100 0
100
200
300
400
500
600
NAD+/NADH -560 mV
最佳电位范围
E/mV, pH 7.0
背景电流低，噪声低，没有分子 氧还原，抗坏血栓、尿酸、扑热 息疼等小分子电极活性物质的氧 化将到最低程度。
8.3.3亚铁血红素
掺杂丁二炔单体,两亲性的磷脂纳米颗粒小体在紫外照射下聚合,形成稳定的
微组装结构.在聚丁二炔的头端修饰上具有特异识别功能的生物分子,在溶液 状态下,待测分子的结合拉动聚丁二炔纳米颗粒的结构变化,从而产生肉眼可
见的蓝-红颜色变化.
酶插头:将黄素辅酶FAD修饰1.4nm直径的金纳米晶体,使其功能化并与
光学测量信号.
电化学研究表明,Cyt C在电极表面的空间取向控制对产生可 逆的电化学反应影响很大.使电极表面带负电会使Cyt C在电极表 面的反应更容易.
图8-4 紫红假单胞菌Cyt C三维结构
8.3.5细胞色素P450
细胞色素P450也是一种以血红素为辅基的b族细胞色素,广泛 存在于各种生物体内.细胞色素P450中,血红素的Fe3+可被还原为 Fe2+,还原型的细胞色素P450与CO结合后在450nm处有最大吸收 峰,故称为细胞色素P450.在其结构序列非常多,如图是甲单胞菌 的细胞色素P450的三维结构.
蛋白都属于血红素蛋白,但为单体,含有一个亚铁血红素基团,能与 氧结合.主要存在与哺乳动物肌肉中,在细胞内起贮存和传递氧作 用.在细胞缺氧时,氧化Mb释放结合的氧供代谢用途.Mb分子的血 红素插入分子裂隙的疏水区.在体内,Mb一般为还原态,当血红素的
四吡咯环和裂隙中疏水氨基酸界面的相互作用使蛋白质结构稳定.
CO也能结合,结合的方式与氧结合方式类似,但结合更加牢固,这
也就是煤气中毒的原因.
图8-11 鲸鱼精肌球蛋白的三维结构
Mb在裸电极上的电子传递速率很慢,需要对电极进行修饰.用 阳离子表面活性剂修饰电极效果比较好,应用比较多.阳离子表面 活性剂能够以特定方式与电极表面结合,并将Mb以合适的空间取 向锚定,利于电子传输.
CDH是将解纤维木质真菌的胞外酶,以白腐真菌CDH研究得最广
泛.该酶催化纤维二糖、乳糖和纤维糊精的氧化。酶的‘头部’ 含有黄素辅酶FAD，‘尾部’含有亚铁血红素。对这两个部位研 究发现， FAD域参与糖氧化步骤，并随之还原双电子受体。然 而在单电子受体情况下，酶的亚铁血红素域将电子从黄素酶FAD 有效地传递到单电子受体。
(a) 图8-12 真菌纤维二糖脱氢酶的三维结构
(b)
纤维二糖
图8-15铜绿假单胞菌醌蛋白乙醇脱氢酶三维结构
二聚体，每个亚基含辅酶PQQ
图8-16 细菌葡萄糖脱氢酶三维结构
8.3.10 PQQ-酶
以吡咯喹啉苯醌(pyrrole quinoline quinon, PQQ)为辅酶的酶属
于醌蛋白(quinoprotein)，发现较晚，多属于脱氢酶。它们与FAD脱氢酶类似，可以催化多种底物的氧化反应，包括糖、醇、胺和 醛类。在生理条件下，这些酶的电子受体不是嘌呤核苷酸，而是 一些可溶性氧化还原蛋白。因此，醌蛋白PQQ酶类可以参与长距
采用超分子组装方法,通过聚丁二炔与金电极上自组装十八烷硫醇单
层膜的结合,形成基本传感器原理.用该传感器研究大肠杆菌与甘露醇之
定在电极上,电极能够提供电子给氧化态的酶,则成为非介导的直 接电子传递模式(也就是直接电子传递): Cpd I + 2e +2H+ POD + H2O
Horseradish peroxidase, HRP
C含有吸附和共价结合 的HRP,经过洗涤之后 N峰下降
由于HRP的血红素辅基埋在分子内部,如果能够引入一个分子导
黄素原酶和葡萄糖氧化酶原酶重组,然后整合到导电膜中,形成生物电催化系 统.该重组系统的电子转移转换速率大约为5000个/s.而天然酶的天然底物分
子氧接受电子的速率为700个/s.金纳米颗粒如同电纳米插头,起到酶氧化中心
的导线作用.
8.4.2过氧化物酶在电极上的重构
8.4.3自组装双层脂膜直接电化学电极
离的电子传递。
PQQ-酶能够在电极上进行直接电氧化，底物转换发生在
PQQ活性部位的和电子传递通过蛋白质分子传递到亚铁血红素氧
化还原部位，再进一步到电极。
8.4直接电化学酶电极研究进展
8.4.1纳米颗粒在直接电化学电极中的应用
纳米颗粒在生物传感器中的应用非常广泛,可以分为如下几类: 1)纳米颗粒标记可以用于生物分子的标记,从而实现信号放大(金银,量子点, 磁性颗粒). 2)纳米颗粒用作固定载体纳米粒子具有高的比表面积,用于生物分子的固定 可以增加固定的分子数量,从而增强反应信号;纳米材料固栽酶或蛋白质后还 可以增强它们的稳定性,利于其电子传输. 3)作为一种新型的智能聚合物,聚丁二炔类化合物引起人们的广泛注意.通过
8.3.1氧化还原酶类
1)需氧脱氢酶类(aerobic dehydrogenase) 以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或黄素单核苷酸(FMN)为辅酶,以氧为直接 氢受体,产物为H2O2或超氧阴离子O2-.如黄嘌呤氧化酶、醛脱氢酶、NADH氧化 酶等。 2)厌氧脱氢酶(anaerobic dehydrogenase) 辅酶或辅基还原后又将氢原子传递至氧化呼吸链，最后将电子传给氧生成水。 在此过程中释放出的能量使ADP磷酸化生成ATP。 3)加氧酶类(oxygenase)
第8章 电化学传感器之五:直接电化学酶电极
8.1概述
经典酶电极 第一代生物传感器 酶电极 介体酶电极 第二代生物传感器 直接电化学生物传感器 第三代生物传感器
电极过程由固定化生物膜和基础电极完成
电极过程由化学介体分子介导 酶分子被直接修饰在电极表面
酶与电极直接进行电子传递速度不快的原因:
1)大多数蛋白质的电活性中心包埋在蛋白质分子深处,距离 电极较远;
嗜热嗜酸菌的细胞色素P450
可能是高温下活性部位的构型变化使高温有利于蛋白质的电子传递
8.3.6过氧化物酶
过氧化物酶都能以过氧化氢为底物,以亚铁血红素为辅因子.
其中,辣根过氧化物酶是使用最广泛的分析用酶之一,可以直接在 电极上进行过氧化氢和其他过氧化物的测定,其酶的三维结构如图:
图8-7 辣根过氧化物酶三维结构 酶为六聚体,每个亚基含有一个血红素
内源性 氧化还原酶 催化反应发生在酶的氧化还 原中心，从中心到分子表面 没有电子转移通道
intrinsic
源自文库
外源性
extrinsic
需要有另外一个蛋白质(称为辅助蛋白) 介入电子转移，电子转移通道处在酶 的表面与辅助蛋白的结合部位。
图8-2 各类辅酶的氧化还原电位
葡萄糖氧化酶 -635mv
黄素酶，PQQ-酶 亚铁血红素-酶
电子受体不是分子氧而是某些辅酶(NAD+、NADP+)或辅基(FAD、FMN)，
催化加氧反应。加氧反应中，氧分子中的一个原子加到底物分子上使之
羟化，另一个氧原子被NADPH2+提供的氢还原成水。 4)过氧化氢酶或过氧化物酶类(peroxidase)
过氧化氢酶催化两个H2O2分子的氧化还原反应，生成H2O并释放出O2.
蛋白质固定在电极表面
蛋白质在溶液中
氧化酶域峰逐渐减小而血红素域峰逐渐增加的可能原因: 蛋白质在电极表面的构型从利于氧化酶域电子传递转变为有 利于血红素域的电子传递;也有可能是氧化酶在电极表面的变
质所致. 所以当蛋白质在溶液中氧化酶峰下降很慢,溶液中
的蛋白质可以更新电极上反应的蛋白质.
在裸的和DDAB修饰的 表面,氧的峰电位大约在0.5到-0.7V,heme的存在 大大降低了氧的过电位
胞能量代谢.血红素蛋白还参与红细胞高铁血红素的还原,以在血
液循环中使生理性高铁血红素维持低水平.
tetraethylorthosilicate(TEOS) 四乙基正硅酸盐
8.3.8肌球蛋白(myoglobin,Mb)
肌球蛋白是一种水溶性蛋白,相对分子量约为17000,它与血红