第八章 酶的应用
酶工程课件 5 第八章_酶定向进化
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8.2.2 基因体外随机突变方法--易错PCR技术
易错PCR应用实例
Chen.K和Arnold采用易错PCR对枯草杆菌蛋白酶进行了 体外进化研究。他们通过降低反应体系中dATP的浓度,对 编码该酶从第49位氨基酸到C端的DNA片段进行易错 PCR,经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺 (DMF)中酶活性明显提高,其中突变体PC3在60%的DMF 中,酶活力是野生型的256倍。将PC3再进行两个循环的定 向进化,得到的突变体酶活力比PC3还要高3倍。
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生物的自然进化
➢进化过程：
突变→自然选择→遗传后代
➢进化结果：
基因多样性： 为完成同一功能所表现出的 多个 基因或同一个基因(同源性)
代谢途径的多样性： 同样产物，多条途径 代谢产物的多样性： 同一底物，不同产物
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如何利用相对简单快速的方法对天然 酶的改造或构建新的非天然酶？
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天然酶的局限性
酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足 酶学研究和工业化应用的要求 稳定性差 活性低使催化效率很低 缺乏有商业价值的催化功能
天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。
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现代生物工程对酶的要求
1、能具备长期稳定性和活性 2、能适用于水及非水相环境 3、能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物 4、进一步增强酶对多种底物的分解能力
用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排 除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为 控制下进行的
8酶的工业应用
可催化L-酪氨酸或邻苯二酚生成多巴。已经制 成固定化酶使用。
多巴是治疗帕金森氏综合症的一种重要药物。 该酶作用pH为3.5-6.0，温度为30-55℃，为控
制氧化进程，应添加维生素C或硫酸肼等抗氧 化剂。
三、酶在药物制造方面的应用
核苷磷酸化酶
可催化阿糖尿苷生成阿糖腺苷；而阿糖尿苷由 尿苷通过化学方法转化而成；
由于酶具有专一性强和效率高的特点，所 以在医药方面使用的酶具有种类多、用量 少、纯度高的特点。
一、酶在疾病诊断方面的应用
根据体液内酶活力的变化诊断疾病
酸性磷酸酶（ACP） • 前列腺癌患者及出现肝炎、甲状旁腺机能亢进、红血 球病变等疾病时，血清中酸性磷酸酶的活力会升高。
碱性磷酸酶（ALP或AKP） • 佝偻病、骨骼软化症、骨瘤、骨骼广泛性转移癌、甲 状旁腺机能亢进、黄疸性肝脏疾病等，患者血清中碱 性磷酸酶活力升高；而软骨发育不全等疾病，引起该 酶活力下降。
脱除苦味和防止出现白色浑浊； 葡萄糖氧化酶：可去除果汁、饮料、罐头食品和果蔬干
制品中的氧气，防止产品氧化变质，防止微生物生长， 延长食品保存期； 溶菌酶：可防止细菌污染，起保鲜作用等。
果胶酶的作用机理
酯化的半乳糖醛酸
柚苷（柚配质-7-芸香糖苷） 橙皮苷（橙皮素-7-芸香糖苷）
四、改善食品的品质和风味
风味酶的发现和应用，在食品风味的再现、强化和矫正 方面有广阔应用前景。例如： 用洋葱风味酶处理甘蓝等蔬菜； 用奶油风味酶（脂肪酶）作用于含乳脂的巧克力、冰 淇淋、人造奶油等食品； 端肽酶水解苦味肽消除苦味； 风味酶用于恢复甚至强化原来的天然风味。
面包制造中，面团中添加适量的-淀粉酶和蛋白酶，可 缩短面团发酵时间，面包品质也有提高。
第八章 酶的定向进化
定向进化与自然进化的异同 点
定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸 和应用。 定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化， 使进化朝着人们需要的方向发展。 两者的不同：
•进化动力不同： 保守突变 非保守取代；
•进化方向不同： 适应突变的积累；
•进化速度不同： 非常漫长
•
只需几年、甚至几天； 超越生物学意义的要
定向进化的应用
目标酶
卡那霉素核苷基 转移酶 枯草杆菌蛋白酶
所需功能
热稳定性 作用于有机溶 剂 作用于新底物 有机溶剂中的 底物特异性和 活性
方法
定位诱变+选择 易错PCR+选择
结果
在60-50℃酶半衰期 增加200倍 在60％二甲基亚砜主 仆女冠活力增强170 倍 对cefotaxime的抗性 增加32000倍 活力增加60-150倍
• 优点：简便，随机的定向进化
DNA 重组技术(DNA Shuffling)
1. DNaseI产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片段复性； 4. 延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段
• DNA改组具有以下有用的特征： • ①它可以利用现存的有力突变，快速积累不同的 有利突变； • ②重组可伴随点突变同时发生； • ③可以删除个体中的有害突变和中性突变。 • 缺点：DNA改组过程中伴随的较高待点突变频率 会严重阻碍正突变组合的发现。由于绝大多数突 变是有害的，有利突变的重组和稀少有利点突变 会被有害突变的负背景所掩盖。
生物多样性：整个生态系统中的生物
什么是定向进化技术
• 概念提出： • 1993年，美国科学家Arnold F H首先提出 酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶 的改造或构建新的非天然酶。
第八章酶免疫技术
酶放大免疫分析技术 示意图
克隆酶供体免疫分析示意图
克隆β-D半乳糖苷酶的两种片段： 酶受体（EA）和酶供体（ED）
二、异相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
Ag+Ab-E
AgAb-E+Ab-E
物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
+
竞争法测抗原
-
E
E
E
3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱
E
E
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
E
E
3、加酶作用 的底物显色
ELISA检测抗体的方法
间接法
方法
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。
底物显色
1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
E E E
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
+
E
E
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
原理
酶标记物与相应的抗原或抗体结合后， 标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
第八章酶工程
按现代观点，酶工程主要包括以下内容 ① 酶的大量生产和分离纯化及它们在细胞外的应用 ② 新颖酶的发现、研究和应用 ③ 酶的固定化技术和固定化酶反应器 ④ 基因工程技术应用于酶制剂的生产与遗传修饰酶的研究 ⑤ 酶分子改造与化学修饰以及酶结构与功能之间关系的研究 ⑥ 有机介质中酶的反应 ⑦ 酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究 ⑧ 抗体酶、核酸酶的研究 ⑨ 模拟酶、合成酶以及酶分子的人工设计、合成的研究
第八章-酶工程
2023/12/28
第八章酶工程
酶工程
一． 概述 二． 酶的命名和分类 三． 酶的化学本质、来源和生产 四． 酶催化反应机理及反应动力学 五． 酶的固定化和固定化酶反应器 六． 酶工程的应用 七． 酶工程的研究进展
第八章酶工程
一 酶和酶工程的概述
（一）、 酶的概念 （二）、 对酶的认识和研究历程 （三）、 酶工程的概念
通过适应、诱导、诱变以及基因工程等方法 培育出新的高产酶的菌株。
第八章酶工程
微生物细胞产生的酶分类 结构酶：在细胞的生长过程中出于其自身需要而表达， 诱导酶：加入相应的诱导剂后才会表达，诱导剂一般是
该酶所催化反应的底物或产物。 一般而言，野生型微生物需要经过遗传改造后，才能变
为高产酶的菌株。其方法包括 ① 物理诱变育种 ② 化学诱变育种 ③ 基因工程构建
第八章酶工程
3）发酵条件控制 营养条件 环境条件，注意溶氧浓度、温度、pH值 特别注意剪气力对蛋白质的影响，因为在高剪
切力下，蛋白质容易失活。 注意发酵的泡沫，因为蛋白质是表面活性剂，
大量的蛋白质积累在发酵液中使得在鼓泡条 件下很容易形成泡沫，影响发酵正常操作。 因此应该考虑除泡装置，并添加消泡剂。
第八章酶工程
酶的化学本质和作用特点
位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。
活性中心外的必需基团
01
02
03
04
05
底 物
活性中心以外的必需基团
结合基团
催化基团
活性中心
靠近效应
定向效应 锁钥学说 诱导嵌合学说 张力作用 酸碱催化作用 共价催化作用
1
2
酶作用的辅助因素
底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分子的敏感键产生“张力”甚至“形变” ，从而促使酶－底物中间产物进入过渡态。
酶 活 性
0.5
1.0
2.0
1.5
0 10 20 30 40 50 60
温度 ºC
温度对淀粉酶活性的影响
pH对酶促反应的影响
1.最适pH
2.pH稳定性
表现出酶最大活力的pH值
在一定的pH范围内酶是稳定的
pH对酶作用的影响机制： 1.环境过酸、过碱使酶变性失活； 2.影响酶活性基团的解离； 3.影响底物的解离。
S
P
（1）
（2）
由于酶催化的反应（2）的能垒比没有酶催化的反应（1）要低，反应（2）所需的活化能亦比（1）低，所以反应速度加快。
反应总能量改变
非催化反应活化能
酶促反应 活化能
一般催化剂催 化反应的活化能
能 量
反 应 过 程
底物
产物
酶促反应活化能的改变
“张力”和“形变” ：
临近定向效应：
在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度； 另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。酶作用的辅助因素3
生物化学(第三版)第八章 酶通论课后习题详细解答 复习重点
第八章酶通论提要生物体内的各种化学变化都是在酶催化下进行的。
酶是由生物细胞产生的，受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。
与一般催化剂相比有其共同性，但又有显著的特点，酶的催化效率高，具有高度的专一性，酶的活性受多种因素调节控制，酶作用条件温和，但不够稳定。
酶的化学本质除有催化活性的RNA分子之外都是蛋白质。
根据酶的化学组成可分为单纯蛋白质和缀合蛋白质是由不表现酶活力的脱辅酶及辅因子（包括辅酶、辅基及某些金属离子）两部分组成。
脱辅酶部分决定酶催化的专一性，而辅酶（或辅基）在酶催化作用中通常起传递电子、原子或某些化学基团的作用。
根据各种酶所催化反应的类型，把酶分为六大类，即氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。
按规定每种酶都有一个习惯名称和国际系统名称，并且有一个编号。
酶对催化的底物有高度的选择性，即专一性。
酶往往只能催化一种或一类反应，作用于一种或一类物质。
酶的专一性可分为结构专一性和立体异构专一性两种类型。
用“诱导契合说”解释酶的专一性已被人们所接受。
酶的分离纯化是酶学研究的基础。
已知大多数酶的本质是蛋白质，因此用分离纯化蛋白质的方法纯化酶，不过要注意选择合适的材料，操作条件要温和。
在酶的制备过程中，没一步都要测定酶的活力和比活力，以了解酶的回收率及提纯倍数，以便判断提纯的效果。
酶活力是指在一定条件下酶催化某一化学反应的能力，可用反应初速率来表示。
测定酶活力及测酶反应的初速率。
酶活力大小来表示酶含量的多少。
20世纪80年代初，Cech和Altmsn分别发现了某些RNA分子具有催化作用，定名为核酶（ribozyme）。
有催化分子内和分分子间反应的核酶。
具有催化功能RNA的发现，开辟了生物化学研究的新领域，提出了生命起源的新概念。
根据发夹状或锤头状二级结构原理，可以设计出各种人工核酶，用作抗病毒和抗肿瘤的防治药物将会有良好的应用前景。
抗体酶是一种具有催化能力的蛋白质，本质上是免疫球蛋白，但是在易变区赋予了酶的属性。
第八章催化水解反应的金属酶
第二节 羧肽酶
• 羧肽酶是催化肽链的C-末端氨基酸残基水解的 酶。 第一个被发现的锌酶 第一个被发现的金属酶 动力学、结构、光谱最清楚的水解酶
• 羧肽酶分类： 金属酶，存在于胰液中，细胞外酶，帮助蛋白 质消化，中性或弱碱性显示极大的活性 非金属酶（酵母羧肽酶C），细胞内酶，在酸 性条件下具有很大活性。
• 证明锌酶中的Zn2+处于畸变四面体配位状态。
第八章催化水解反应的金属酶
第八章催化水解反应的金属酶
• 碳酸酐酶研究中，钴酶活性是锌酶活性的 50%，而Ni2+，Mn2+，Fe2+酶仅稍具活性， 其它惰性。
• Co2+取代酶大都能在不同程度上保持酶的 催化活性。
• 电子结构、离子半径、配位几何构型。
第八章催化水解反应的金属酶
第八章催化水解反应的金属酶
水解酶根据水解键的类型不同分为六个亚类。
• 酯酶 • 糖苷酶 • 醚酶 • 肽酶 • C-N酶 • 酸酐酶
作用于酯键，使其水解为酸和醇 作用于糖基化合物，使糖键水解 作用于醚键，使其水解 作用于肽键，使其水解 作用于其它C-N键 作用于酸酐
本章仅对肽酶及酯酶作一些介绍
第八章
第八章催化水解反应的金属酶
• 第一节 概 述 • 第二节 羧 肽 酶 • 第三节 碳 酸 酐 酶
第八章催化水解反应的金属酶
第一节 概述
根据酶催化反应的类型，把酶分为六类 ：氧化还原酶类 催化 Nhomakorabea化还原反应
转移酶类 催化功能基团转移反应
裂解酶类
催化从底物移去一个基团而留下 双键的反应或其逆反应
• EPR、Mössbauer、d-d电子光谱－金属酶存 在某种过渡金属。
• Zn2+,Ca2+,Mg2+等离子不具有未充满的d轨道， 因此含有Zn2+,Ca2+,Mg2+等离子的金属酶就难以 应用上述检测技术获得有用信息。
第八章酶在果蔬类食品生产中的应用
研究表明，用果胶酯酶和聚半乳糖醛酸酶处理 苹果汁有很好的效果，但大部分商品酶对柠檬 汁、酸橙汁等pH值低的果汁的澄清作用不理想， 原因主要是过低的pH值抑制了酶的活性，研究 发现利用酶作用的产物即聚半乳糖醛酸可以起 到澄清作用。
固定化多酶系统（果胶酶、淀粉酶）
现在的研究趋向是使用固定化的多果胶酶系统 讲行果汁澄清，这些酶中包括降低果汁粘度、 降解果实组织的酶，甚至包括除去果汁中淀粉 的淀粉酶系统，因为一般果汁中都含有一些淀 粉，这些淀粉的存在会引起贮藏过程中果汁的 混浊，必须除去。
基因枪原理
导入ACC合成酶反义基因的番茄
Hamilton等于1990年首次构建了ACC氧化酶反 义RNA转基因番茄，在纯合转基因番茄果实中， 乙烯的合成被抑制了97%，从而使果实的成熟 延迟，贮藏期延长。导入ACC合成酶反义基因 的番茄也得到了类似的结果。转基因番茄的乙 烯合成也被抑制了99.5%，果实中不出现呼吸 跃变，叶绿素降解和番茄红素合成也都被抑制。 果实不能自然成熟，不变红，不变软，只有用 外源乙烯处理6天后才能使转基因番茄正常成 熟。因此，利用反义基因技术可以成功的培育 耐贮藏果蔬。
8.3 控制酶的基因表达进行果 蔬保鲜
控制果实成熟的酶
促进果实和器官衰老是乙烯最主要的生理功能。 在果实中乙烯生物合成的关键酶主要是乙烯在 直接前体—1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACC 合成酶)和ACC氧化酶。在果实成熟中这两种 酶的活力明显增加，导致乙烯产生急剧上升， 促进果实成熟。
基因技术控制酶的表达
在对这两种酶基因克隆成功的基础上，可以利 用反义基因技术抑制这两种基因的表达，从而 达到延缓果实成熟，延长保质期的目的。利用 反义RNA技术抑制酶活力已有许多成功的例子， 其中最成为成功的就是延缓成熟和软化的反义 RNA转基因番茄。
第八章 血清酶类测定
标本（血清或血浆）
临床酶学测定酶之前，标本还要经过采集、分离和储存等一系列处理过 程。而酶在血中处于一个动态变化过程，血液离开机体后还会有一定变 化。因此在其中任何一个阶段处理不当，都有可能引起测定值的变化。
标本应避免溶血：
大多数酶在血细胞中的含量比在血浆中高得多 ，少量 血细胞的破坏就可能引起血浆中酶明显升高。如红细胞 内的LD、AST和ALT活性分别较血清中高150、15和7倍左 右，故测定这些酶时，样品应避免溶血。
肝硬化
ALT增高程度与肝硬化的活动度和肝组织炎症改变及肝细胞损害程 度相一致。对ALT进行监测有助于对肝硬化病情的判断。若是静止 性肝硬化，则ALT维持正常 ；肝硬化病人的转氨酶出现较大幅度 的升高，提示病情可能发展成活动性，须引起警惕。
肝癌
80%—90%肝细胞都是在肝硬化基础上发生的，因此，在早期，ALT是否增高 主要决定于肝硬化的活动程度。若是静止性肝硬化，则ALT维持正常，因为 肝细胞发生癌变时，细胞并没有坏死破坏，ALT没有释放出来，因此，ALT 没有升高，或ALT有轻度或中度增高。
方法评价
1. 操作简便，易于普及，能较好反映酶的真实活性。故卫生 部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖 氏法。
2. 不适用自动分析仪；试剂稳定性差,底物缓冲液不易保 存(易长菌); 反应中丙酮酸生成量与ALT活性不能呈现良好 的线性关系，这是赖氏法的最大缺陷。
(二)速率法
转氨酶的测定多用比色法，以赖氏法最常用。目前， 国内外实验室多采用连续监测法进行测定。 ALT速率法测定中酶偶联反应式为：
（六）在诊断肿瘤中的应用
具有器官特异性的有ACP及其同工酶、ALP及其同工酶、γ-G T及其同工酶、AFU、AMY及其同工酶、LPS等；非器官特异性 的有ALT、CK同工酶、ALD同工酶、LD同工酶等。
酶的作用和作用机理图
酶的作用和作用机理
酶是一种生物催化剂，能够促进生物体内化学反应的进行。
它们在细胞内起着
关键的作用，参与各种代谢和合成过程。
酶主要通过降低反应的活化能来加速反应速率，从而促进化学反应的进行。
酶的作用
酶在生物体内担任多种重要功能，包括但不限于以下几个方面：
1.代谢调节: 酶能够调节代谢途径中的不同步骤，使代谢反应按需进行，
从而维持生物体内稳态。
2.消化: 消化酶在肠道中促进食物的消化，将食物中的大分子物质分解
为小分子，以便生物体吸收。
3.免疫反应: 某些酶能够参与免疫反应，破坏病原体或调节免疫系统的
活性。
4.DNA复制和修复: 酶在DNA复制和修复过程中起着至关重要的作用，
确保基因组的稳定。
酶的作用机理
酶的作用机理主要可以归结为以下几点：
1.底物结合: 酶能够与底物特异性结合，形成酶-底物复合物。
这种结合
有利于酶调控底物的构象，从而降低反应的活化能。
2.催化反应: 酶通过提供合适的环境，促进底物分子之间的相互作用和
化学键的断裂和形成。
这种作用类似于锁和钥的配合，使反应更容易发生。
3.产物释放: 反应发生后，酶能够释放产物，重新进入下一轮催化过程。
这样，酶可以持续地催化反应，不断加速代谢过程的进行。
综上所述，酶在生物体内具有多种重要作用，其作用机理主要包括底物结合、
催化反应和产物释放等步骤。
通过这些作用，酶能够实现高效、特异性地促进生物体代谢的进行，维持生命的正常运转。
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矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。