分子生物学实验项目三

实验三植物基因组DNA的提取

实验目的

通过本实验学习从植物组织中提取DNA的方法。

实验原理

利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。

仪器、材料与试剂

（一）仪器

1低温离心机

2 恒温水浴锅

3 台式离心机

4 琼脂糖凝胶电泳系统

5 微量加样器

（二）材料与试剂

1 三羟甲基氨基甲烷（Tris）

2 乙二胺四乙酸（EDTA）

3 氯化钠（Nacl）

4 β-巯基乙醇

5 氯化钾（KCl）

6 异丙醇

7 乙醇

8 琼脂糖

9 十二烷基硫酸钠（SDS）

10 50mL离心管

11瓷研钵

12 吸头、小指管

13 细胞提取液

100mmol/L Tris.HCl(PH 8.0)

5 mmol/L EDTA(PH 8.0)

500 mmol/L Nacl

1.25% SDS

1 mmol/L β-巯基乙醇

14 5 mol/L KCl

15 TE缓冲液

10 mmol/L Tris.HCl(PH 8.0)

1 mmol/L EDTA(PH 8.0)

16 哥伦比亚野生型拟南芥（Arabidopsis Columbia）三周幼叶。

17 TIANGEN基因组DNA提取试剂盒（Plant Genomic DNA Kit）（离心柱型）。

实验步骤

一、自配试剂提取步骤

1 取4g新鲜叶片，在液氮中充分研磨成粉末状（越细越好）。

2 将研磨好的粉末转移至50mL的离心管中，加入16mL细胞提取液，充分混匀，65℃水浴保温20min。

3 从水浴中取出离心管，加入5mL5mol/L的KCl溶液，混匀，冰浴20min。

4 4000r/min离心20min。

5 降上清液转移到另一50mL的离心管中。

6 加等体积的酚/氯仿混匀，12000 r/min离心5min，取上清。

7 加等体积氯仿，混匀，12000r/min离心5min，取上清。

8 加入0.6-1倍体积的异丙醇（沉淀DNA），混匀。

9 离心获得沉淀，加70%乙醇洗涤3次，风干沉淀。

10加入500μLTE缓冲液，溶解DNA。

11取3 mL上清液，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量。

二植物基因组DNA提取试剂盒提取步骤

1、拟南芥基因组DNA的提取

以野生型拟南芥(Arabidopsis Columbia)2周幼叶为材料（称取叶片约100毫克），用TIANGEN基因组DNA提取试剂盒（Plant Genomic DNA Kit）（离心柱型）按以下步骤提取基因组DNA：

1) 取干净幼叶100mg，加入液氮充分研磨。

2) 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴中20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。

3) 加入700μL氯仿，充分混匀，12000rpm(13,400хg)离心5分钟。

4) 小心的将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μL的缓冲液GP2，充分混匀。

5) 将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm(13,400хg)离心30秒，弃掉废液。（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心）。

6) 向吸附柱CB3中加入500μL去蛋白液GD（用前已加入无水乙醇），12000rpm(13,400хg)离心30秒，弃掉废液。

7) 向吸附柱CB3中加入700μL的漂洗液PW（用前已加入无水乙醇），12000rpm(13,400хg)离心30秒，弃掉废液。

8) 向吸附柱CB3中加入500μL的漂洗液PW，12000rpm(13,400хg)离心30秒，弃掉废液。

9) 将吸附柱CB3放回废液收集管中，12000rpm(13,400хg)离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CB3置于室温或50℃温箱放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10) 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL经65-70℃水浴预热的洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm(13,400хg)离心30秒，将DNA溶液收集到离心管中。

11) 离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12000rpm(13,400хg)离心2分钟。

（注意：洗脱缓冲液的体积不应小于50μL，体积过小影响回收效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解）。

2、实验结果

提取得到的DNA应为一条带。

3、实验结果分析

1）DNA浓度及纯度检测

用紫外分光光度计在230nm、260 nm、280 nm和310 nm上检测DNA样品的光吸收，通过吸收值计算DNA样品的浓度，并判断DNA样品的纯度。其中260 nm

的读数用来估计样品中DNA的浓度，OD

260/ OD

280

与OD

260

/ OD

230

的值用于估计DNA

的纯度，310 nm为背景吸收值。1OD

260

=50μg/mL双链DNA或40μg/mL单链DNA。

样品浓度（μg/mL）=[ OD

260- OD

310

]×稀释倍数×50

对于DNA纯制品，其 OD

260/ OD

280

≈1.8，OD

260

/ OD

230

应大于2。OD

260

/ OD

280

>1.8

说明有RNA污染；OD

260/ OD

280

<1.8说明有蛋白污染。

2）用琼脂糖凝胶电泳检测核DNA的完整性时，完整性好的基因组DNA应是一条较为清晰单一的电泳条带，若降解则成弥散状。若RNA未除净，会在电泳前缘出现斑点。

3）如果DNA沉淀呈白色透明状而且溶解后成粘稠状，说明DNA含有较多的多糖类物质，可在取材前将植物放在暗处24小时，以达到去除淀粉的目的。

4）DNA沉淀成棕色，难以酶切

植物材料中含有大量酚类化合物，与DNA共价结合，使DNA呈棕色，并抑制DNA酶的酶解反应。为防止此情况出现，可在加入2×CTAB的同时加入2-5%的β-巯基乙醇，或者加入亚精胺（100μLDNA加入5μL0.1mol/L的亚精胺）。

5）DNA中含有多糖或盐类

将DNA用100%的乙醇或异丙醇沉淀出来，离心，沉淀用70%的乙醇清洗两次获更多次，吹干后重溶于TE中（注意乙醇一定要吹干，否则电泳点样时，样品上漂）。

6）DNA已降解电泳条带呈弥散状

样品降解可能有两种情况：一是机械振动过于剧烈，二是操作过程中DNase 污染。在提取DNA的各个操作过程中要避免剧烈振荡，提取液及用品要高温高压灭菌。另外，使用Tip头吸取过程中应避免产生气泡，Tip头应剪去Tip头尖，避免反复冻融DNA。