棕果番茄果实颜色遗传及gf位点序列变异分析

Abstract：Exocarp，mesocarp，endocarp，and placenta colors were recorded from ripe fruits of each individual in the F2 population derived from a cross between the red-fruited line OH 88119 and brown-fruited line Black Cherry. Without considering the color of lycopene，the exocarp color and mesocarp/endocarp color inherited independently with one gene each. Genomic DNA was amplified from tomato lines Black Cherry and Purple Cherry by PCR with gene-specific primers. cDNA was also obtained from 8 brown lines using RT-PCR with the same gene-specific primers. Comparing to the sequences of GF gene in red-fruited tomato line，a substitution of T/C occurred in coding regions of Black Cherry， Heifanqie （9T） -h， Heifanqie-2012 and Ziguo （Round） ， a deletion of AT occurred in coding region of Ziguo （Oval） ，and an insertion of A in coding regions of Purple Cherry，Ziyu（F1）-h-h and Chocolate Cherry. These mutants belonged to gf 4，gf 3 and gf 2，and formed novel stop codon. A Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence（dCAPS）marker for identifying gf 3 and gf 4 was developed based on the sequence
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variations，which will provide a tool for marker-assisted selection of brown fruit in tomato. Key words：tomato；brown fruit；gf gene；sequence variation 番茄（Solanum lycopersicum）因其丰富的果实颜色变异而被作为模式植物广泛用于果实成熟和 颜色形成机理研究。在果实成熟过程中，叶绿素逐步降解，有色体合成，使得成熟的番茄果实显现 不同的颜色 （Klee & Giovannoni， 2011） 。 如红果番茄果实成熟过程中， 叶绿素和复杂的类囊体消失， 叶绿体变成了以番茄红素为主的质体（Cheung et al.，1993；Giuliano et al.，1993） ，成熟果实为红 色。但是，绿果肉（green-flesh，gf）番茄突变体材料在果实成熟过程中叶绿体并不完全消失，存在 滞绿（Staygreen）现象，成熟果实中既有质体，也有叶绿体，使得果实颜色呈现锈红色到棕色甚至 紫/黑色，称之为棕果、紫果或黑果（Kerr，1956；Barry & Pandey，2009） 。与富含花青苷的紫果番 茄不同的是，这类番茄果实中并不含有高水平的花青苷（ Mes et al. ， 2008 ） ，而是由于编码 STAYGREEN 蛋白的基因 SGR 发生了突变（Barry et al.，2008） ，使得叶绿素降解不完全，与番茄红 素同时存在于成熟果实中。 在红果或粉果番茄中沉默 SlSGR1 基因都导致成熟果实为棕色 （Hu et al.， 2011；Luo et al.，2013） ，进一步验证了该基因在棕果颜色形成中的作用。 已有的研究表明，SlSGR1 基因就是以前报道的 GF 基因（Barry et al.，2008；Hu et al.，2011； Luo et al.，2013） 。gf 突变体中该基因的第 3 个外显子发生了单核苷酸替换（A/T） ，导致氨基酸从精 氨酸变成苏氨酸，进而影响基因的正常功能（Barry et al.，2008） 。Barry 和 Pandey（2009）对 26 个 被称为棕果、紫果或黑果的番茄地方品种中的 gf 位点进行基因组 DNA 序列分析发现，gf 存在 5 个 等位基因，分别为 gf、gf 2、gf 3、gf 4 和 gf 5，与红果中对应的 GF 基因的序列相比，gf 和 gf 4 为单核 苷酸替换突变，gf 2 为单核苷酸（A）插入突变，gf 3 为 2 bp 缺失突变，gf 5 为 1 163 bp 缺失突变，根 据 PCR 产物大小可直接检测 gf 5； 同时还建立了两个 CAPS （Cleaved Amplified Polymorphic Sequence） 标记来分别检测 gf 和 gf 2。根据已有的基因组序列信息和 GF 基因的 mRNA 序列推测 gf 4 中单核苷 酸插入导致终止突变， gf 3 中 2 bp 缺失和 gf 2 中 1 bp 插入均导致移码后形成终止突变 （Barry & Pandey， 2009） 。但是到目前为止还没有从这些突变体中分离出 gf 位点的 mRNA 序列，因此上述推测尚未被 证实。本试验中采用 RT-PCR 技术从 8 个棕果番茄材料中扩增 gf 位点的 cDNA 序列，并与红果中对 应的 GF 基因的 cDNA 序列进行比较分析，同时对‘Black Cherry’的果实颜色遗传进行研究，建立 鉴定 gf 3 和 gf 4 位点的 dCAPS（Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）标记，这些结果可 为进一步研究 SlSGR1 基因的功能，在育种中利用棕果材料以及标记辅助选择提供参考。
收稿日期：2014–08–12；修回日期：2014–10–27 基金项目：国家重点基础研究发展计划（ ‘973’计划）项目（2012CB113900） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yangwencai@cau.edu.cn）
肖良军，陆佳楠，李 宁，刘小茜，杨文才. 棕果番茄果实颜色遗传及 gf 位点序列变异分析. 园艺学报，2015，42 (1)：38–46.
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1.1
材料与方法
植物材料 采用 10 个番茄材料，其中 8 个为棕果材料，两个为红果材料（表 1） 。 ‘黑番茄 （9T） -h’ 、 ‘黑
番茄–2012’和‘紫玉 （ F1 ） -h-h’由新疆农垦科学院作物研究所李艳研究员提供，其余材料由本课 题组收集保存。 将红果材料‘OH 88119’与棕果材料‘Black Cherry’杂交获得 F1，并加代得到 F2 分离群体。 亲本、F1 和 F2 分离群体于 2013 年春季种植在纱棚中，3 月 5 日播种，4 月 27 日定植。按照常规生 产要求进行田间管理。这些材料用于果实颜色遗传分析和基因型与性状的连锁分析。 2014 年春， 将 8 个棕果材料和 2 个红果对照种植于日光温室中， 供果实颜色观察、 基因组 DNA
Genetics of Fruit Color and Sequence Variation of gf Locus in Brown Tomato Lines
XIAO Liang-jun，LU Jia-nan，LI Ning，LIU Xiao-xi，and YANG Wen-cai*
（Beijing Key Laboratory of Growth and Developmental Regulation for Protected Vegetable Crops， Department of Vegetable Science，China Agricultural University，Beijing 100193，China）
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Leabharlann Baidu
园艺学报 Acta Horticulturae Sinica 2015，42 (1)：38–46. doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0694；http：//www.ahs.ac.cn
棕果番茄果实颜色遗传及gf位点序列变异分析
肖良军，陆佳楠，李 宁，刘小茜，杨文才*
（中国农业大学蔬菜学系，设施蔬菜生长发育调控北京市重点实验室，北京 100193）
摘
要：将番茄红果材料‘OH 88119’与棕果材料‘Black Cherry’杂交获得 F2 分离群体。通过对成
熟果实外果皮、中果皮/内果皮和胎座颜色的观察，在不考虑番茄红素颜色的情况下，外果皮和中果皮/内 果皮的颜色分别由一个基因控制，且独立遗传。用 gf 位点特异引物经 PCR 和 RT-PCR 扩增和测序，获得 了‘Black Cherry’和‘紫色圣女果’的基因组 DNA 序列以及 8 个棕果番茄的 cDNA 序列，与红果材料中对 应的 GF 位点序列相比， ‘Black Cherry’ 、 ‘黑番茄 （9T） -h’ 、 ‘黑番茄–2012’和‘紫果 （圆） ’的编码区出 -h-h’ 现了一个 T 与 C 替换， ‘紫果 （椭圆） ’编码区缺失了两个核苷酸 AT，而‘紫色圣女果’ 、 ‘紫玉 （F1） 和‘Chocolate Cherry’则在编码区插入了一个 A，这些突变分别属于 gf 4、gf 3 和 gf 2 类型，都形成新的终 止密码子。根据序列差异建立了可用于鉴定 gf 3 和 gf 4 的 dCAPS（Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）标记，为棕果番茄的标记辅助选择提供工具。 关键词：番茄；棕果；gf 基因；序列变异 中图分类号：S 641.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）01-0038-09
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Xiao Liang-jun，Lu Jia-nan，Li Ning，Liu Xiao-xi，Yang Wen-cai. Genetics of fruit color and sequence variation of gf locus in brown tomato lines. Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (1)：38–46.
和 RNA 提取。 1.2 叶片褪绿性状与果实颜色观察 按照 Barry 和 Pandey（2009）的方法观察 10 个番茄材料的叶片褪绿情况。将完全展开的第 4 复叶的顶端小叶取下，放在存有一定水的培养皿中使叶片漂浮于水上，将培养皿用封口膜密封后再 用铝箔纸包裹起来，23 ℃下暗保存 2 周后观察叶片颜色的变化。每个材料观察两个单株，每个单株 取 5 片小叶。在果实成熟期，每个植株取 2 ~ 3 个果实，用小刀切开，分别观察记载果实的外果皮、 中果皮、内果皮和胎座的颜色。 1.3 gf位点DNA扩增、序列分析和dCAPS标记设计 采用改良的 CTAB 法（Kabelka et al.，2002）从 3 个番茄材料‘OH 88119’ 、 ‘Black Cherry’和 ‘紫色圣女果’ 植株的幼嫩叶片中提取基因组 DNA。 用 1 对基因特异引物 （U316068F： 5′-GGACTTTT ATCAAACAGCTAACTTGCA-3′， U316068F：5′-GGCACAACCCAACTTACAATAATTGTA-3′） （Barry & Pandey， 2009） 从这 3 个材料的基因组 DNA 中扩增 gf 位点的 DNA 片段。 PCR 反应体系为 20 μL， 包括约 10 ng 基因组 DNA 模板、10 mmol · L-1 Tris-HCl、50 mmol · L-1 KCl、1.5 mmol · L-1 MgCl2、 100 μmol · L-1 每个 dNTP、0.3 μmol · L-1 每个引物和 1 个单位 Taq DNA 聚合酶（天根生化科技有限 公司，北京） 。PCR 反应条件为：94 ℃变性 5 min，38 个循环的 94 ℃变性 1 min、54 ℃退火 1 min 和 72 ℃延伸 3 min，最后在 72 ℃下保持 5 min。 PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后，用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒回收目的 DNA 片段。将回收 的 PCR 产物与 PMD-19T 载体构建重组质粒，并将连接产物转至大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中，通 过对菌液 PCR 检测获得阳性克隆， 每个材料随机选取 3 个阳性克隆的菌液送到北京三博远志生物技 术有限责任公司测序。用 DNAMAN 软件去除测序片段中的载体序列，拼接后进行序列间的比对。 根据序列比对结果，采用 dCAPS Finder 2.0（Neff et al.，2002）设计 dCAPS 标记（正向引物： 5′-CTATTGGTTTGATATTGTTTAC-3′ ， 反 向 引 物 ： 5′-CTGAGAATTATTGTGGCTT-3′ ） ，用于检测 ‘Black Cherry’中的 SNP。 1.4 gf位点cDNA扩增和序列分析 从 10 个材料的植株上取幼嫩叶片，采用 Trizol 法提取总 RNA。首先用 Promega 的反转录试剂 盒合成单链 cDNA， 然后采用上述基因特异引物扩增 gf 位点的 cDNA 序列。 PCR 反应体系为 50 μL， 包括 2 μL cDNA 模板，5 μL 10 LA Taq BufferⅡ（Mg2+ Plus） ，8 μL dNTPs（2.5 mmol · L-1 each） ， 正向引物和反向引物各 1 μL，0.5 μL LA Taq DNA 聚合酶（宝生物工程有限公司，大连）和 32.5 μL ddH2O。PCR 反应条件为：94 ℃变性 5 min，36 个循环的 94 ℃变性 40 s、57 ℃退火 40 s 和 72 ℃的 延伸 1 min 30 s，最后一步反应在 72 ℃下保持 5 min。对 PCR 产物进行测序和序列分析。 1.5 OH 88119 Black Cherry的F2 群体基因型分析 采用改进的 CTAB 法 （Kabelka et al.， 2002） 提取双亲、 F1 和 F2 群体中每个单株的基因组 DNA， 用本试验中设计的 dCAPS 标记对每个单株的基因型进行分析。 PCR 反应体系为 20 μL，包括 2 μL（约 10 ng）基因组 DNA 模板、8 μL Taq10 2 Master Mix（北 京奥赛博科技发展有限公司） 、 1 μ L （ 10 μ mol · L-1 ）每个引物和 8 μL ddH2O。PCR 反应条件为： 95 ℃变性 5 min，38 个循环的 95 ℃变性 30 s、50 ℃退火 30 s 和 72 ℃延伸 30 s，最后在 72 ℃下保