遗传多样性研究中的分子生物学方法

　第3期　1996年

东北师大学报自然科学版

JO U RN A L O F NO RT HEA ST NO RM A L U N IV ERSIT Y

N o.3

1996

遗传多样性研究中的分子生物学方法

黄百渠　曾庆华　尹　东

(东北师范大学遗传与细胞研究所,长春,130024)

摘要　论述了遗传多样性研究在物种保护中的地位,并介绍了同工酶和蛋白质

分析,限制性片段长度多态标记,多聚酶链式反应,随机扩增多态性DNA,扩

增和错配对检测以及基因克隆和转移等分子生物学技术在遗传多样性研究中的

应用和前景.

关键词　遗传多样性;分子生物学方法;物种保护

1　遗传多样性与物种保护

1.1　重要性　遗传多样性是用以衡量一个种,亚种或种群内基因变异性的概念,它是生物多样性的基础,它在生物界中是广泛存在的,在一个自然群体中,不会有两个个体的遗传背景是一致的.高度的遗传多样性是维持物种长期生存的基础,这是因为由单一纯合个体组成的群体对环境不断变化的压力不能有效地适应.人们发现很多灭绝或受到威胁的物种有非常高的遗传纯合性,在相当程度上,它们的灭绝是遗传多样性的减小或丢失引起的,很明显,遗传多样性的保护是对人类及生活环境中可再生生物资源保护的一个极其重要的方面.

1.2　研究方面　同生物多样性其它等级(物种和生态系统)相比,遗传多样性显得多变而且不稳定,因此,更难精确地解释与测量.然而,由于遗传多样性是其它多样性的基础,所以对一个特定物种或群体遗传背景和结构的知识的掌握是保护和利用这一物种或群体的基础.例如,遗传多样性的重要尺度是基因频率.一特定群体遗传多样性的变化通常是通过描述一定基因频率变化来体现的.低频率的等位基因经传代会通过一种被称为随机基因漂移过程而丢失.这会导致群体适应性的降低,因此要注意保护这些低频基因以维持高的遗传多样性和群体生存性.此外,除了环境的变化和人类的影响等因素之外,遗传隔离(例如,群体中缺乏基因的交换)是物种灭绝的主要原因.通过增加杂交亲和性和其它种群基因掺入等手段将帮助打破遗传隔离和促进多样性.遗传多样性的研究主要包括两方面,一是检测和确定物种或种群内的基因结构组成、变异及其种间的遗传和进化关系;二是在此基础上建立并发展保护和利用基因资源的手段和措施.

收稿日期:1996-05-10

—

90

—

2　分子生物学方法

同其它生物多样性的研究相比,遗传多样性的研究目前并不深入.因为要想进一步深入研究基因结构会遇到很多困难.研究这些问题的传统方法包括对大量的可遗传的性状的分析,以及通过细胞学的方法对染色体形态,结构及有丝分裂和减数分裂过程中形态变化的观察.最近,由于染色体标记和原位杂交技术的应用,使得发生在染色体上的变异能够更加特异地被确认和定位.

过去几十年分子生物学的迅速发展给遗传多样性的研究提供了新的手段和方法.一类新的遗传标记的应用,即在遗传分析和基因图谱构建中应用分子标记,使得对物种基因结构的描述更加仔细和深入.这使得不同来源遗传变异可在基因水平或它们的产物水平上进行检测和比较.进而分子克隆和重组DNA技术在基因保护、保持生物多样性中起着重要作用.

下面是一些有关分子生物学技术以及它们现在和将来应用于遗传多样性研究的例子.

2.1　同工酶和蛋白质分析　同工酶和蛋白质是基因的产物.由凝胶电泳揭示的同工酶和蛋白质组成的变化可以反映编码它们的基因的变异.它简单而且快速,并已广泛应用于种内或种间变异性及动物系统学的研究.这一方法的主要缺点是一种生物的同工酶和蛋白质易受环境和生长阶段变化的影响,因此在对同工酶和蛋白质的多态性评价时要注意区别是由遗传变异还是由其它因素引起的.此外,有些蛋白质成分并不一定是基因的直接产物.

2.2　限制性片段长度多态性(RFLP)标记　RFLP是在DNA分子水平上的遗传标记〔1〕.当一特定生物的基因组DNA用一种(或几种)限制性内切酶消化后就会产生大量不同长度的限制性片段,然后通过电泳把这些片段分离并印迹到滤膜上,DN A片段在滤膜上变性并与基因组DNA互补的放射性标记的探针进行杂交,通过放射性自显影,由探针识别的限制性片段可看作为一系列代表这些特异性片段数目和长度的带型.当研究不同个体基因组DN A时,片段的数目和长度可发生多态性变化,这能直接反映基因组DNA的结构差异.由相同的限制性内切酶和特异性探针产生的多态性可认为是按孟德尔遗传的标记.如果应用足够数量的限制性内切酶和探针组合,一特定物种的RFLP图谱就可以建立起来.RFLP图谱通常比基于表型标记的遗传图谱具有更高的密度和分辨率.因此,可以绘出更详细的遗传结构图谱.RFLP普遍存在于生物界中,它们以共显等位基因的形式出现,所以它们很容易被检测到.在研究不同基因组变异时,RFLP图谱和标记是极其有用的.

2.3　多聚酶链式反应(PCR)　这一新的有效的DNA扩增技术,是在80年代后期伴随着耐热DNA多聚酶的发现而创建的.PCR过程是以一对特异性寡核苷酸(20-30)作引物,通过模板DNA变性,引物退火及用DNA聚合酶延伸引物的重复循环而迅速扩增DNA片断.由于在每一循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环的模板,在几小时内的30～40次的PCR循环中将产生上百万拷贝的扩增产物.PCR扩增极为敏感、迅速和特异,并且只需要微量的DNA模板.这一技术对特异性DNA片段的克隆和测序分析有较高的应用价值.现在通过PCR技术可以对博物馆档案以至化石标本进行基因追溯.

—

—

91

PCR技术的其它应用包括直接DNA测序,DNA探针的特异性标记,并可用于原位DNA 突变的检测.这一方法的局限性是需预先知道待扩增的DNA两个旁侧区域的序列.

2.4　随机扩增多态性DNA(RAPD)　RAPD是基于PCR技术的另一种新的遗传标记〔2〕.在这一方法里,所用PCR引物是混合的随机序列较短的寡核苷酸,而不是一对特异性引物.这些随机引物可以结合到DNA片段上.DNA片段上不同位置被扩增后,用琼脂糖凝胶电泳分离.被特定随机引物扩增的特定DNA片断,对于一种生物的基因组DNA是稳定的.因此可以作为该物种的遗传标记.RAPD已被于遗传图谱,动植物的分类学和系统学,以及种间种内变异及多样性的研究.它在鉴定和确定受体生物中外源基因和染色体片断的存在也同样有价值.

2.5　扩增和错配对检测(AM D)　AMD分析法是PCR与化学错配对方法的结合,用来扩增和检测某一个体的基因组DNA的特定区域.用参照样本的PCR产物(如,要检测突变,就用正常个体DNA)进行放射性标记并与过量的待测个体的PCR产物混合.混合物变性然后复性进行杂交.参照链与其它链之间存在的任何变异将影响碱基配对,这些错配对的位点对定的化学修饰敏感(如羟基胺对胞嘧啶,锇酸对胸腺嘧啶),并能被相应的化学处理裂解.处理过的DNA片断变性,电泳和放射性自显影.从自显影胶片上可见到突变点到标记末端的距离以确定裂解物的大小.AM D是检测结构和点突变的敏感方法.

2.6　基因克隆和转移　外源基因的克隆和转移现在已成为分子生物学实验室的常规实验方法.这些技术开辟了保护和促进遗传多样性的新手段.例如,对受威胁或灭绝物种基因文库的建立,并进行低温长期保存.用这种方法保留有价值的遗传资源有时比保护存活个体和组织要容易和有效.另外,来自一个体的有益基因可以被分离和克隆,然后转移到另外的生物体内产生转基因植物和转基因动物,以提高物种适应性(例如,高的抗病能力以及对恶劣条件的耐受性等).

参考文献

1　Gyllensten,U B and H A Erlich.Generation of single-s tranded DNA by the polymerase cham reaction and its application to direct s equencing of the H L-DQA locu s.Proc Natl Acad Sci,1988,85:7652 2　Schar f S J,G I Horn and H A Erlich.Direct cloning an d sequen ce an alys is of enzym atically amplified gen om ic sequences.Science,1986,223:1076

Molecular Approaches in Studies of Genetic Diversity

Huang Baiqu　Zeng Qing hua　Yin Dong

(Institute of Genetics and Cytology,Northeas t Normal University,Changchun,130024)

Abstract　In this paper,the sig nificance and aspects of studies in genetic diversity and species conservation w ere discussed.Some m olecular approaches that are useful in stud-ies of life div ersities and species co nser vation were introduced.

Keywords　g enetic diver sity;m olceular appr oaches;species protectio n

—

—

92