第四章发酵工业培养基及与原料处理

用法：前体使用时普遍采用流加的方法
前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07% 前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化， 流加也有利于提高前提的转化率
3、产物促进剂 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又 非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。
对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的 水。
第三节 淀粉水解糖的制备
淀粉水解制糖的意义 1. 大多数微生物不能直接利用淀粉（所有的氨基酸生产菌不 能直接利用） 2.有些微生物能够直接利用淀粉作原料，但必须在微生物产 生淀粉酶后才能进行，过程缓慢，发酵周期延长。
3.若直接利用淀粉作原料，灭菌过程的高温会导致淀粉结块， 发酵液粘度剧增。
二、淀粉酸水解制糖
（一）淀粉酸水解的理论基础
1.淀粉的水解反应
遇水加热 温水 130℃
淀粉
膨胀
糊化
溶解或液化
水解过程：
总反应式： (C6H10O5)n+nH2O 过程：(C6H10O5)n C6H12O6 (C6H10O5)x nC6H12O6 C12H22O11
淀粉 键均被切断。
糊精
麦芽糖
葡萄糖
项目 DE值 羟甲基糠醛（％） 色度 淀粉转化率 工艺条件 过程耗能 副产物 生产周期 设备规模 防腐要求 适合发酵工艺情况 酸解法 91 0.3 10 90 高温加压 多 多 短 小 高 差 酸酶结合法 95 0.008 0.3 95 高温加压 多 中 中 中 较高 中 酶解法 98 0.003 0.2 98 常温 少 少 长 大 低 有利
=k（a-x）
促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方 面的。
有些促进剂本身是酶的诱导物；
有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产， 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；
有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。
五、水
对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在 不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。 水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶 性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。 对于酿造行业，水的重要性不言而喻
H+对作用点无选择性，a-1,4-糖苷键和a-1,6-糖苷
淀粉水解产生葡萄糖的理论得率：
180 162 *100%=111%
2.淀粉酸水解反应动力学
符合一级化学反应，反应速率与反应物质的浓度成正比。 dc dt
-
=kc
C-淀粉浓度；k-反应速率常数，越高表示反应速率越快。
设定水解时淀粉浓度为a，经过t时间后起反应的量为x，剩 下的未起反应的淀粉浓度为（a-x），则： dx
1、生长因子
从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机 物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。
如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷 型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重 要的作用 。 有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源 含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可 缺少的生长因子
一、淀粉水解糖的制备方法 原料主要有：薯类（木薯、甘薯、马铃薯）、玉 米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉。 根据催化剂不同分为三类： 1.酸水解法（acid hydrolysis method）
以无机酸为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。 优点： 工艺简单、水解时间短、设备生产能力大。 缺点： 设备耐高温高压、耐腐蚀；副产物多，影响水解液的质量；对 原料要求高，淀粉颗粒大小均匀，否则水解不彻底。
不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响
糖蜜使用的注意点： 除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许 多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。
例：谷氨酸发酵
有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶） 生物素（发酵控制） 预处理：澄清→脱钙→脱除生物素 例：柠檬酸发酵 有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成） 预处理：→黄血盐
有些产物会受氮源的诱导和阻遏
例： 蛋白酶的生产
有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力
开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣
的课题
三、无机盐的微量元素
1、作用：各种不一样 2、来源：C、N源，以盐的形式补充
3、用量：根据具体的产品，以实验决定，
4、使用注意点 A. 对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑
第四章：发酵工业培养基 及原料处理
培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长 繁殖 所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生 物培养提供除营养外的其它所必须的条件。
发酵培养基的作用： 满足菌体的生长 促进产物的形成
发酵培养基的要求
① 培养基能够满足产物最经济的合成。 ② 发酵后所形成的副产物尽可能的少。 ③ 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源 丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的 供应。 ④ 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响 通气、提取、纯化及废物处理等。
例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml 发酵罐必须进行表面处理 B、使用时注意盐的形式（pH的变化）
例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，P对酶活的影响
pH 4.25 5.45 4.62 酶活 120分钟 30分钟 75分钟
不加 加 K2HPO4 加 KH2PO4
四、生长因子、前体和产物促进剂
二、按状态
固体培养基 :适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应 用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产 半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂， 一般用量为0.5%～0.8% ,主要用于微生物的鉴定。 液体培养基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性 的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。
(半纤维素酶)
No Image
(1.5g麸皮)
李江华，无锡轻工大学学报，2004
嗜碱芽胞杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响
苏勤，林业化学与工业，2004
结果：各种碳源相差不大 推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型
二、氮源 氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、 核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机 氮源和无机氮源。 1、无机氮源 种类：氨盐、硝酸盐和氨水 特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓效氮源。 但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如： (NH4)2SO4 → 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 → NH3 + 2H2O + NaOH
工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质
量指标
葡萄糖当量值 （dextrose equivalent value）
还原糖 DE=
干物质
*100%
不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大
② 糖蜜 糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。 糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达45%～50%。一般糖蜜分 甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。
无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸 性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸 性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢 后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如 硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程 的pH有积极作用。
所以选择合适的无机氮源有两层意义：
生产周期长（一般48h）；要求的设备多，投资大；
酶本身是蛋白质，糖液过滤困难。
3.酸酶结合法（ acid-enzyme hydrolysis method ） （1）酸酶法
淀粉
酸水解
糊精、低聚糖
Fra Baidu bibliotek
降温、中和
糖化酶
葡萄糖（糖化）
玉米、小麦等谷物淀粉，颗粒坚实，若用淀粉酶液化短时间内往往不彻 底。此法液化速度快，可采用较高的淀粉乳浓度，提高了生产效率；用酸量 较小，产品颜色浅，糖液质量高。
满足菌体生长 稳定和调节发酵过程中的pH
毛霉产蛋白酶的研究
陈涛，中国酿造，2004
初始pH的影响:
pH偏酸比较好，中性蛋白酶影响大
无机氮源的影响： 硫酸铵>硝酸铵>硝酸钠>尿素
2、有机氮源 来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼 粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋 白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒 糟。 成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机 盐及生长因子。 例 玉米浆： ①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 ②较多的乳酸 ③硫、磷、微量元素等
化生产 原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性
培养大肠杆菌常用两种培养基
M培养基(1L)： Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g， NaCl 0.5g， NH4Cl 1g， MgSO4.7H2O 0.5g， CaCl2 0.011g，葡萄糖 2-10, pH 7.0
YPS培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母 提取物（英国Oxoid）5g, NaCl 10g，PH 7.2
第一节 培养基的类型及功能
培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型 一、按纯度
合成培养基 : 原料其化学成分明确、稳定
适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律 培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业
生产 天然培养基: 采用天然原料
原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业
有机氮源成分复杂可以从多个方 面对发酵过程进行影响，而另一方面 有机氮源的来源具有不稳定性。所以 在有机氮源选取时和使用过程中，必 须考虑原料的波动对发酵的影响
氮源使用的一些相关问题：
有机氮源和无机氮源应当混合使用
早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源 中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质
③
淀粉、糊精 使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类 缺点：难利用、 发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的α-淀粉酶 成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。 优点：来源广泛、价格低 难利用，可以解除葡萄糖效应
例：地衣牙孢杆菌生产α-淀粉酶
碳源对生长和产酶的影响
碳源 葡萄糖 蔗糖 糊精 淀粉 细胞量 4.2 4.02 3.06 3.09 α-淀粉酶 0 0 38.2 40.2
2.酶水解法（enzyme hydrolysis method）
a-淀粉酶 糖化酶
淀粉 优点：
糊精、低聚糖(液化)
葡萄糖（糖化）
条件温和，设备要求低；酶专一性强，副产物少；
淀粉液初始浓度较高，要求低，淀粉转化率高；
糖液颜色浅，较纯净，无异味，有利于糖液的充分利用； 可用粗原料，省去粗原料加工成精制淀粉的过程。 缺点：
2、前体 前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生 物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结 构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大 的提高。
青霉素：分子量356
苯乙酸:分子量136
作用：前体有助于提高产量和组份 用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化 率的问题 例：6000单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸 青霉素＝6000*0.6（微克）＝36mg/ml 苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38% 实际使用时的转化率在46-90%之间 例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素） 转化率为：0.6/(0.337*36/13.8)=68%
三、按用途（从发酵生产应用考虑）
培养基按其用途可分为孢子（斜面）培养基、种子培养基 和发酵培养基三种
第二节 发酵培养基的成分及来源
一、碳源 1、作用 提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需 的碳成分 提供合成目的产物所必须的碳成分 2、来源 糖类、油脂、有机酸、正烷烃
3、工业上常用的糖类 ① 葡萄糖 所有的微生物都能利用葡萄糖 但是会引起葡萄糖效应
（2）酶酸法
a-淀粉酶 酸水解
淀粉
糊精、低聚糖(液化)
葡萄糖（糖化）
针对颗粒大小不一的淀粉（碎米淀粉），减少原料损失，提高原料利用 率15%左右；生产较易控制，可采用较高淀粉乳浓度；生产周期短，提高生 产效率；酸水解pH可控制稍高，减少淀粉副反应的发生，糖液色泽较浅， 质量较好。
不同糖化工艺的比较