翻译MtPARMYB转录因子作为一个开关参与苜蓿原花色素合成

MtPAR MYB转录因子作为一个开关参与苜蓿原花色素的合成
摘要：MtPAR（蒺藜苜蓿原花色素调节子）是myb蛋白家族的转录因子，在模式豆科植物苜蓿的原花色素（PA）的合成中起关键调控作用。

MtPAR在种皮中表达，pa积累的部位。

功能缺陷的Par突变体种皮中的pa含量比野生型低很多，然而花色素和其他专门的代谢物水平是正常的。

相反，当MtPAR在转基因苜蓿的毛状根中异常表达时，pa却大量积累。

对par突变体和MtPAR表达的毛状根进行转录分析，结合酵母单杂交分析，发现MtPAR 很可能通过激活WD40-1，从而正向调控编码类黄酮到pa合成途径中的酶的基因。

MtPAR 在牲畜饲料的紫花苜蓿中表达，导致根中含有可观察到的pa含量，突出了这一潜在增加牧草植物中pa含量的基因生物技术的战略，降低以此为食的反刍动物的气胀。

原花色素（pa，也成缩合单宁）是黄烷-3 -醇单元的低聚物，pa复合物在种皮，叶，果实，花，许多植物的树皮中都有分布。

Pa，儿茶素，表儿茶素是对人体健康有益的抗氧化剂，包括保护心脏，抗癌，消炎。

牧草植物中的Pa与蛋白结合，减慢在反刍动物的瘤胃的发酵，降低了微生物产生的甲烷含量，从而使动物免受可能致死的气胀病的危害。

牧草植物中等水平的pa含量，可以改善氮素营养，减少尿氮排泄，有利于抵抗肠道寄生虫。

不幸的是，很多豆科植物，包括世界上最重要的牧草植物，紫花苜蓿，没有足够多的pa来抵抗食草动物的胀气病。

因此，提高苜蓿和其他饲料豆科植物根中pa含量成为生物技术的一个重要目标。

Pa的合成和调控在非豆科植物的模式植物拟南芥中已研究清楚。

拟南芥中pa的合成知识大部分来自于tt突变体，表现为种子色素沉着较少。

20个tt基因已被鉴定，它们编码参与pa 合成及储存或者调控pa产量的蛋白的酶或者转运子。

转运子包括一系列的转录因子：tt2，myb家族的转录因子；tt8，bHLH转录因子；ttg1，WD40蛋白，共同组成一个调控花色素还原酶转录的三聚体。

最近，已经从模式豆科植物苜蓿中分离和鉴定了参与pa合成的几个关键的基因/酶和一个转运子的前体。

然而，我们对苜蓿和其他豆科植物pa的生物合成知之甚少，，只有一个WD40重复结构的转录因子有牵连，在紫花苜蓿种子的正调控pa的合成。

苜蓿的全基因组转录因子研究和其他在种子发育过程中被激活的基因中，锁定了超过30个诱导种子的转录因子用于反向遗传学功能鉴定。

其中一个编码调控苜蓿种子pa合成的myb蛋白家族的转录因子。

这个基因在转基因毛状根的异常表达导致pa合成和积累。

因此，这个myb转录因子具有提高牧草单宁水平的潜力。

结论：
MtPAR编码一个在种皮中特异表达的myb转录因子
图1：MtPAR基因
的表达。

MtPAR在
种子发育不同阶
段和在种子不同
组织中的表达情
况。

我们使用了苜蓿的基因表达谱来筛选诱导种子的转录因子基因用于遗传鉴定。

其中之一，MtPAR，编码一个假定的R2R3类的myb转录因子，基于其蛋白N末端高度保守的R2和R3 myb DNA结合结构域。

MtPAR仅在种子中表达，授粉后24天表达量最高。

定量rt-pcr 表明这个基因在种皮中特异表达，在胚和成熟种子的胚乳中不表达。

距离分析，没有发现MtPAR和参与花青素或者pa合成的myb转录因子之间有密切联系。

最接近同源的MtPAR 是大豆里一个功能未知的myb蛋白。

Par突变体在种皮pa积累中是有缺陷的
我们通过转座子插入MtPAR基因分离了四个独立的突变体。

群体中在NF4419的第二个外显子中，NF2466，NF1358，NF3308的第三个外显子中发现了Tnt-1插入。

与野生型相比，这四个插入突变体分离得到的纯合株系的成熟种子色素沉着减少。

在发育种子中，四个
突变体的MtPAR转录水平不到野生型的5%。

图2：苜蓿par突变体分析
A：不同的Tnt-1插入MtPAR的位置和相
应的突变体株系的名称。

线表示内含子，矩形
表示外显子。

B：NF4419突变体株系中突变对种子色
素沉着的影响。

在另一个突变体株系中也观察
到了相似的表型变化。

C：NF2466突变体株系成熟种子的dmaca
染色
D：提取物中pa水平（可溶的和不可溶的）
与各自相应的对照。

Dmaca染色表明，与野生型相比，突变体的成熟种子中pa含量降低。

发育种子的Dmaca 染色表明，在授粉后10天到16天中，突变体和野生型pa含量都呈现出相似的，逐渐积累。

授粉后20-24天，突变体和野生型之间的差异开始明显，这个现象与野生型的MtPAR在授粉后24天后表达量最高相一致。

电镜观察突变体和野生型种子dmaca染色的横切面，很大程度上局限在种皮，表明MtPAR表达的组织特异性。

par突变体种子的可溶解的和不可溶解的pa水平都低于各自的对照，突变体可溶解的pa含量比对照低50%，不溶解的pa含量比对照低80%。

高效液相色谱分析表明，par突变体和野生型的各种pa二聚体分布相似。

花青素的分光光度分析表明，par突变体和野生型种子没有明显差异。

结论，MtPAR调控的是
种子中pa，而不是花青
素。

MtPAR异常表达诱导
pa合成
图3：在苜蓿毛状根中过
表达MtPAR
A：过表达MtPAR转化
株的毛状根的表型。

左：
gfp作为转化标记。

中和右：dmaca未染色和染色的毛状根
B：在14个不停毛状根转化体中可溶pa和花青素浓度与MtPAR表达水平的相关。

为了探究MtPAR在pa合成中的作用，我们使用了组成型表达启动子35S结合MtPAR 的cDNA来转化苜蓿的毛状根。

利用土壤农杆菌来转化含有使转化的毛状根可见的gfp标记和p35S:: Mt PAR载体到苜蓿中。

通过qRT-PCR检测苜蓿毛状根中MtPAR的异常表达。

观察最初的未染色的毛状根发现，与转化p35S::GUS的毛状根相比，p35S::Mt PAR的红色较浅。

在根生长和其他形态学特征中没有观察到p35S::GUS和对照有明显的差异。

然而，随后用dmaca染色后观察，发现p35S::Mt PAR和p35S::GUS有了明显的差异，前者用dmaca 染色后电镜显示为蓝绿色，暗示pa的存在，然而对照却没有。

可溶的pa水平在对照p35S::GUS转基因植物的毛状根中含量很低，但比p35S::Mt PAR 含量高100倍以上。

此外，可溶的pa浓度和MtPAR的转录水平成正相关。

相反，不溶解的pa水平在对照转基因植株毛状根中含量很低，并没有因为MtPAR的表达而增加。

花青素浓度在对照转基因植株毛状根中含量高，但是在p35S::Mt PAR株系中，随着可溶的pa水平增加，花青素浓度降低。

MtPAR调节pa合成基因的表达
为了研究MtPAR引发pa生物合成的机制，我们使用基因芯片对突变体和野生型种子，p35S::Mt PAR和p35S::GUS转化的根进行转录组分析。

比较授粉后20天种子的转录水平，发现了49个在par突变体和野生型差异表达的基因。

其中，与野生型相比，par突变体38个基因的转录水平低，11个基因的转录水平高。

根据GeneBins ontology，14个在突变体中被抑制的基因编码参与原花色素合成的酶。

有些事pa和花青素合成都需要的（例如，查尔酮合酶，chs；类黄酮-3-羟化酶，f3h；花色素合酶，ans），然而其他基因在ans下游起调控作用，只调节pa的合成。

在突变体中表达水平高的基因大多功能未知。

在转p35S::Mt PAR的苜蓿毛状根中，171个基因表达水平明显不同于对照p35S::GUS。

其中，115个基因表达水平高于对照。

115个基因中的11个编码类黄酮合成的假定的酶。

为了确定MtPAR直接调控的基因，我们把突变体中被抑制的基因与转化p35S::Mt PAR 植株中被诱导的基因进行了比较。

12个基因同时满足两个条件，8个编码参与pa和花青素合成途径的酶。

这些编码ans和anr的基因，表茶儿酸合成的最后两步，影响苜蓿中pa的合成。

使用突变体种子和毛状根的异常表达的转录本数据，综合分析类黄酮合成途径中所有基因家族成员的表达。

此分析确定了MtPAR对类黄酮合成途径中两个中心酶（chs和f3h），一个特殊调节pa和花青素合成的开关的酶ans的调控作用。

图4：MtPAR在类黄酮途径调控
中的作用。

A：类黄酮生物合成途径到pa和花青
素的流程图。

*表示转录水平在突变
体株系和过表达株系中都受到显著
影响的酶。

B：授粉后20天的par突变体种子和
过表达株系中参与类黄酮合成的假定基因的渐增表达情况。

C：相比野生型对照，par突变体成熟种子中显著变化的代谢物含量。

为了评价par突变体在类黄酮代谢途径的影响，我们使用uplc和ms进行了代谢物分析。

成熟种子中鉴别出74个有关的代谢物，与野生型相比，par突变体的19个代谢物变化显著。

这些代谢物主要属于四类复合物：香豆酸和香豆素化合物，三萜皂苷，表儿茶酸和类黄酮配糖类，分别有2个，8个，2个和7个。

尽管各自的皂苷类代谢物在par突变体中不同，突变体和对照的皂苷类的总量并没有显著差别。

香豆素和香豆酸也是同样情况。

相反，突变体的表茶儿酸含量比野生型低了45.9%，类黄酮配糖含量比野生型高23.2%。

在par突变体中表儿茶酸减少的量反映了可溶解pa水平的降低。

总之，遗传学，转录本和代谢分析的结果表明，苜蓿的MtPAR在pa合成中起着正调控作用。

MtPAR作用于WD40-1上游
之前，在苜蓿中发现一个WD40重复结构蛋白，与拟南芥TTG1基因同源，称为MtWD40-1.苜蓿WD40-1突变体的可溶和不溶pa含量急剧下降。

然而，在苜蓿毛状根中过表达MtWD40-1，花青素浓度升高，pa浓度没有受到影响。

我们读MtWD40-1突变体和par 突变体进行了对比。

相比野生型对照，par突变体有38个基因在授粉后20天的种子中下调，，wd40-1突变体有16个基因在授粉后16天种子中下调。

此外，这16个基因中有14个与花青素合成有关。

为了检验Mtpar和MtWD40-1是否通过一个共同的途径诱导目标基因，我们做了定量pcr来检测par突变体中WD40-1的表达。

显然，授粉后20天的种子，不同的par突变体的wd40-1的转录水平比野生型低15-50倍。

相反，在授粉后16天种子中，par 转录水平并没有因为wd40-1的突变而受到影响。

此外，过表达MtPAR诱导了苜蓿毛状根中MtWD40-1的表达。

我们随后做了酵母单杂交来研究par，wd40-1和anr启动子之间的直接互作。

MtPAR激活了wd40-1启动子的转录，而不是anr启动子。

图5：par激活WD40-1的表达
A：不同突变体株系中授粉后20
天种子中MtWD40-1的表达情况。

B：毛状根转化体中MtWD40-1的
表达情况。

AB：两个看家基因
MSC27和PDF2的表达情况。

C：酵母单杂交分析。

上：酵母单
杂交实验中使用的报告基因表达
盒。

MtWD40-1启动子和MtPAR
启动子克隆岛报告基因AUR1-C
前，在酵母中具有aba抗性。

中：
没有在酵母中发现WD40-1启动
子和anr启动子的本底表达。

下：
在携带par效应子表达盒的质粒转
化酵母单杂交报告株系后酵母的
生长情况。

MtPAR的异常表达诱导pa在苜蓿叶片中积累
为了研究是否可以利用MtPAR在苜蓿叶中大量生产pa，我们得到了超过300个过表达MtPAR的苜蓿转基因株系。

在组成型启动子35S的驱动下，测试的转基因的苜蓿株系中，几乎一半的苜蓿的也和茎的MtPAR转录水平明显高于对照。

用基于dmaca实验对叶和茎中提取的pa进行分析，表明这些转基因株系中pa有低水平的积累。

Pa产量与MtPAR表达水平呈正相关。

使用串联ms进一步证明了pa 的存在。

在过表达MtPAR的转基因苜蓿叶片提取物中，检测到了表儿茶酸和表儿茶酸己糖苷，儿子野生型苜蓿叶片提取物中没有检测到信号。

讨论：
MtPAR是pa合成的一个正调控因子
我们在苜蓿中鉴定了MtPAR，myb R2R3转录因子家族的一个成员。

这个基因亲缘关系最近的是大豆中一个功能未知的myb蛋白基因。

我们的数据表明，MtPAR对pa在苜蓿种子中合成的调控扮演着重要的角色。

第一，MtPAR基因的表达局限在种皮，发育种子中pa积累的部位。

第二，Tnt1插入功能缺失的par突变体中，pa在种皮中的积累明显低于野生型对照。

第三，在par突变体中，花青素水平保持正常，尽管产生pa前体和花青素合成共用一个途径。

第四，除了种皮颜色明显变浅外，par突变体的其他器官没有明显的表型异常。

第五，在根中过表达MtPAR，导致通常情况下不积累pa的根部有了可溶pa的积累。

第六，在par突变体中被抑制的基因和在根中过表达MtPAR诱导的基因，大部分参与类黄酮和pa 合成。

这些假定目的基因包括：3个chs基因，2个f3h基因，1个ans基因，pa和花青素合成都需要的基因，还有一个pa合成单独需要的anr基因。

鉴于在par突变体中许多pa和花青素合成都需要的基因被抑制了，与野生型相比，突变体种皮中花青素水平不变，而pa水平大大下降，这个结果很有意思。

以下假说可以解释。

第一个假说：如果MtPAR在积累花青素的细胞中不表达，pa的减少可以通过类黄酮配糖的增加，而不是花青素的增加来抵消。

另一个解释涉及到代谢物通道，如果anr和ans结合，ans的产物，3-OH-花青素，将通过anr优先转变为表儿茶酸（而非pa），而不是被糖基化生产花青素。

理想的ans和anr的解耦合可能导致花青素相对高于表儿茶酸。

在控制pa合成的调控网络中，MtPAR激活MtWD40
我们对豆科植物中类黄酮合成的转录调控知之甚少。

在非豆科植物拟南芥中，有6个位点具有调控pa合成的功能，TT1, TT2, TT8, TT16, TTG1 ,和TTG2。

TT1 和TT16分别编码一个锌指和mads box蛋白，是种子色素沉着必不可少的。

TTG2 编码一个WRKY转录因子，作用于TTG1下游。

TT2 , TT8 ,和TTG1分别编码一个MYB ，一个bHLH和一个WD40蛋白，相互作用组合成一个转录因子三聚体复合物。

这些转录因子中任何一个突变都会通过类黄酮合基因的下调影响种子中pa浓度。

在苜蓿par突变体中，我们也观察到类黄酮途径关键基因的下调。

我们对苜蓿中pa合成基因的调控了解甚少。

与拟南芥AtTTG1同源的MtWD40-1，一个WD40重复结构的转录因子，被认为是苜蓿种子中pa合成的正调控子。

我们比较了苜蓿中MtWD40-1和MtPAR的作用后，发现，两者可能属于同一个调控网络。

两类突变体都表型为pa水平显著下降。

此外，转录组分析表明，在这两个基因分别缺失的突变体中，有一系列共同的基因表达下调。

基因表达分析也表明，在par突变体株系中，MtWD40-1表达水平降低。

反过来，在wd40突变体中，MtPAR的表达水平并没有受到影响。

酵母单杂交实验表明par和wd40-1启动子在酵母体内直接互作，但是par和anr启动子没有直接互作，这也
暗示了，在植物中，par通过直接影响wd40-1表达来调控类黄酮-pa途径中编码酶的基因。

这个发现可以解释，为何是MtPAR的过表达，而不是Mt wd40-1的过表达影响了根中pa 的合成。

如果在苜蓿中，像拟南芥一样，也需要一个转录因子复合体来诱导类黄酮合成的基因，那么过表达MtPAR，随后诱导Mt wd40-1的表达，可能为根中合成pa提供必需的转录因子。

相反，过表达Mt wd40-1将不会诱导MtPAR的表达，也不会诱导下一步的pa合成。

MtPAR作为改良豆科植物中pa含量的工具
有望通过生物技术手段提高豆科植物根中的pa含量来降低气胀病的发生。

因为有激活整个代谢途径的潜力，转录因子在这个方面受到特别关注。

例如，过表达pap1后烟草和拟南芥中合成了花青素，就像苜蓿的lap1一样。

然而，通过相似的途径增加豆科牧草植物中pa含量尚未成功。

MtPAR为利用生物技术手段提高粮食和牧草品种中pa含量带来了希望。

确实，过表达MtPAR导致pa在苜蓿毛状根中大量积累，同时参与pa/花青素合成的多个基因（包括chs，f3h，ans和anr）的表达也增加了。

这个结果表明MtPAR的表达足够诱导pa在器官中积累，而不是在通常发挥作用的种子中积累，尽管MtPAR转录因子的活性可能还需要其他的蛋白，例如，MtWD40-1。

在苜蓿中稳定的组成型的过表达MtPAR，导致pa在根中积累，尽管积累水平还远远低于抵抗胀气病的水平（约20㎎/g干重）。

无论如何，这个发现至少是牧草植物中pa途径的一个进步，为未来应用于基因工程改良苜蓿抵抗胀气病提供了可能。