SDS-PAGE电泳标准操作流程

SDS-PAGE电泳标准操作规程

1目的

建立SDS-PAGE电泳的标准操作规程,确保电泳操作有序进行，保证电泳的安全性、有效性。

2范围与职责

适用SDS-PAGE电泳操作岗位。配制岗位操作人员对本标淮实施负责，QA检查员、生产主管负责监督。

3程序：

3.1制胶

3.1.1组装胶架

将洁净、无水的玻片薄玻璃片，插入橡胶框的深凹槽中，

将洁净、无水的厚玻璃片，插入橡胶框的厚凹槽中，形成

空腔，确保橡胶框贴合。将组装后的玻璃板放于电泳槽中，

拧紧螺栓，将玻璃板固定住，注意上端平齐，整体垂直，

不能偏斜。电泳槽组合完毕后，不能漏水。用加热后的1%

琼脂糖溶液，将玻璃板的下端封住，将玻璃板与橡胶框的

缝隙封住。

3.1.2分离胶的配置

3.1.2.110%分离胶配方如下表：

3.1.2.2灌胶

混匀后用将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板梳齿下缘约2cm)。

3.1.2.3液封

在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。

3.1.3浓缩胶的配置

3.1.3.15%浓缩胶配方下表：

3.1.3.2插入制胶梳

混匀后用将凝胶溶液沿玻棒注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。约30分钟，聚合完全。

3.2电泳

3.2.1加入电极液

根据电泳槽的体积，量取相应的5X 电极液，用三蒸水稀释5倍，用6M HCl，调pH8.3，加入电泳槽中。注意保持液面在短玻璃板上方5mm以上。

3.2.2样品处理

对于蛋白样品直接取40µl的样品，依次加上10µl 5x buffer (加了B-巯基乙醇)，混匀。对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer (加了B-巯基乙醇)煮沸10分钟。

3.2.3加样

用微量取样器取处理过的样品溶液40μl，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker 加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。

3.2.4电泳

将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。电流调至60mA 保持恒流。待溴酚蓝标记移动到浓缩胶底部时，将电流调至110mA，保持恒流，待溴酚蓝标记移动到分离胶底部时，关闭电泳。停止电泳，把电泳缓冲液倒掉。

3.2.5剥胶

把两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶跟琼脂糖封胶刮掉，取下分离胶。

3.2.6固定

将两块分离胶放于盛有固定液的大玻璃皿中，固定液漫过胶即

可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约0.5小时，完成

后固定液回收并用水洗掉胶上的固定液。

3.3. 染色

将放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇

床上，转速约为45r/min，时间约0.5小时，完成后染液回收

并用水洗掉胶上的染液。

3.4.脱色

取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约4小时，每1小时换一次脱色液，待本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。

3.5.拍照

将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出（用前也可用酒精棉球擦干净文件夹），放到扫描仪上，拍照。

4. 注意事项

4.1 根据目的蛋白的大小选择合适的胶片浓度。一般为100KD-50KD

选用10%胶；50KD-30KD选用12%胶；30KD-10KD选用15%胶。

4.2 要根据样品浓度来加样品溶解液。每加一个样品后换一支吸头

或清洗吸头后再点另一个样品。

4.3 制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作。

4.4 电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。

4.5 分离胶高度控制得当，确保有大约2cm左右的浓缩胶空间。过长或过短均不能得到理想的电泳结果。

4.6 电泳染色液注意进行回收再利用，一般可重复使用2-3次。

4.7 AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很

慢甚至不聚合，过多则聚合过快，影响倒胶。