【CN109825532B】CRISPRCas12a基因编辑系统在小立碗藓基因编辑中的应用【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利

(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201910159312.X (22)申请日 2019.03.04

(65)同一申请的已公布的文献号

申请公布号 CN 109825532 A (43)申请公布日 2019.05.31

(73)专利权人 中国科学院昆明植物研究所

地址 650000 云南省昆明市盘龙区蓝黑路

132号(72)发明人 刘莉　普晓俊　刘丽娜　李萍　

杨红　(74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569

代理人 刘奇(51)Int.Cl.

C12N 15/90(2006.01)C12N 15/82(2006.01)A01H 5/00(2018.01)(56)对比文件

CN 103571868 A ,2014.02.12,

CN 109321548 A ,2019.02.12,

CN 107446924 A ,2017.12.08,CN 108486146 A ,2018.09.04,CN 106244591 A ,2016.12.21,CN 107312761 A ,2017.11.03,

刘丁源.利用多重gRNA介导的CRISPR/Cas技术对拟南芥IAA2和小立碗藓LrgB基因编辑的研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）》.2017,

J.Z. and M.W.等.Multiplex gene

editing in rice with simplified CRISPR-Cpf1 and CRISPR-Cas9 systems.《Journal of Integrative Plant Biology》.2018,第60卷(第8期),

杨帆等.新一代基因组编辑系统CRISPR/Cpf1.《生物工程学报》.2017,第33卷(第3期),

审查员 习洋

(54)发明名称

CRISPR/Cas12a基因编辑系统在小立碗藓基因编辑中的应用(57)摘要

本发明提供了CRISPR/Cas12a基因编辑系统在小立碗藓基因编辑中的应用，属于基因工程技术领域，所述应用包括以下步骤：1)构建Cas12a 蛋白酶表达载体；2)构建gRNA表达载体；3)采用Cas12a蛋白酶表达载体、gRNA表达载体和表达抗性的质粒对小立碗藓进行转化，经过抗性筛选得到突变体植株。本发明应用于小立碗藓基因编辑的CRISPR/Cas12a基因编辑系统具有基因编辑效率高、脱靶概率小、尤其能够高效编辑多靶标的

优点。

权利要求书1页 说明书11页

序列表5页 附图4页

CN 109825532 B 2019.12.10

C N 109825532

B

权　利　要　求　书1/1页CN 109825532 B

1.CRISPR/Cas12a基因编辑系统在小立碗藓基因编辑中的应用，包括以下步骤：

1)将两端带有核定位信号的编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列连接到质粒pAct-Cas9上，用pActinpromoter启动表达，得到Cas12a蛋白酶表达载体；

2)将gRNA连接到质粒pU6-sgRNA上，用PpU6 promoter启动表达，得到gRNA表达载体；

3)采用步骤1)所述Cas12a蛋白酶表达载体、步骤2)所述gRNA表达载体和表达抗性的质粒对小立碗藓进行转化，经过抗性筛选得到突变体植株；

所述步骤1)和步骤2)没有时间顺序限制；

所述两端带有核定位信号编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述gRNA包括至少一个gRNA单元和一个7个胸腺嘧啶碱基的终止序列；所述gRNA单元和7个胸腺嘧啶碱基的终止序列顺次连接；

当gRNA单元的数量≥2时，所述gRNA单元串联连接；

所述gRNA单元包括顺次连接的成熟的crRNA和设计的靶基因序列；

所述成熟的crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤3)中所述小立碗藓为原丝体阶段的小立碗藓。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，步骤1)中所述编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列连接到质粒pAct-Cas9上的NcoI和XbaI酶切位点之间。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤1)中所述连接的体系为：以10μL计，包括pAct-Cas9质粒4.5μL、编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列3.5μL、T4 DNA连接酶1μL和T4 DNA连接Buffer 1μL；所述连接的程序为：4℃，连接9～12h。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述gRNA连接到质粒pU6-sgRNA上的NcoI和XbaI酶切位点之间。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述连接的体系为：以10μL计，包括pU6-sgRNA质粒3μL、gRNA 5μL、T4 DNA连接酶1μL和T4DNA连接Buffer 1μL；所述连接的程序为：4℃，连接9～12h。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，步骤3)中所述Cas12a蛋白酶表达载体、gRNA表达载体和表达抗性筛选的质粒的体积比为0.5～1.5:0.5～1.5:0.5～1.5；所述Cas12a蛋白酶表达载体的浓度为0.5～1.5μg/μL；所述gRNA表达载体的浓度为0.5～1.5μg/μL；所述表达抗性筛选的质粒的浓度为0.5～1.5μg/μL。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤3)中所述表达抗性的质粒为表达潮霉素抗性的质粒。

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