真核基因在大肠杆菌中的表达形式

真核基因在大肠杆菌中的表达形式
大肠杆菌被内膜与外膜隔成3个腔:胞内、周质与胞外,表达的蛋白定位于这3个腔内。

真核基因在大肠杆菌的表达形式根据表达产物的定位一般可分为两类:胞内表达与蛋白分泌表达。

胞内表达就是最主要的表达形式,表达产物以可溶性蛋白与/或不溶性的包涵体形式存在于大肠杆菌细胞内。

而根据表达产物本身的性质又分为融合表达与非融合表达。

一、胞内表达
1、非融合表达
非融合表达即直接表达天然蛋白,所表达的真核生物蛋白肽链的N端不含有任何原核肽段。

真核基因通常缺乏能被原核生物的转录与翻译系统识别的序列,包括启动子、有效地核糖体结合位点,有时还缺乏ATG起始密码子与转录终止子,因此必须插入带有这些调控序列的表达载体方能表达。

有时,非融合表达不能产生目的蛋白,尤其就是目的蛋白的氨基酸含有甲硫氨酸时。

由于甲硫氨酸就是由ATG编码的,在大肠杆菌中,氨基端的甲硫氨酸会被不同程度地去除。

此外,非融合蛋白易被宿主蛋白酶破坏,产生无活性的蛋白,这就是影响表达效率的重要因素。

克服的方法有:①采用Ion-营养缺陷型宿主。

大肠杆菌蛋白酶的合成主要依赖于黄嘌呤核苷(Ion),用Ion-宿主,使蛋白酶不能合成,从而保护真核蛋白;②克隆Pin基因。

T4噬菌体Pin基因产物为细菌蛋白酶抑制剂,将Pin基因克隆到质粒上,并转化大肠杆菌,可保护真核蛋白。

2、融合表达
融合表达即表达的真核蛋白肽链N端含原核生物肽段,融合表达的方法就是将真核基因插入启动子后已证实能高效表达的原核结构基因的下游,以产生融合蛋白的方式表达目的基因。

由于融合基因5'端为表达载体中的原核基因序列,已优化的翻译起始区的二级结构不受插入外源基因的干扰,因此,融合表达的效率高。

需要注意的就是,插入基因的转录方向与阅读框架必须与原核片段的阅读框架相吻合,不能产生移码,否则不能表达。

融合蛋白需经处理后方能释放出真核蛋白,常用的后处理方法有溴化氰与蛋白酶裂解,这就要求融合蛋白在其原核肽段与目的蛋白间应含有能被溴化氰与蛋白酶裂解的序列,而且目的蛋白内部不能含有溴化氰与蛋白酶切割位点。

溴化氰能切割蛋氨酸残基后的肽键;牛凝血因子X用Russel蝰蛇毒液活化成因子X a后,能在四肽序列Ile-Glu-Gly-Arg中的精氨酸(Arg)后特异地切割肽链;凝血酶(thrombin)也能识别与切割特定的肽序列,这些识别序列通常都已构建于融合表达载体中。

融合表达有以下几个优点:
①由于转录与翻译的起始由正常的大肠杆菌序列调控,因此融合蛋白通常得到高效表
达;
②真核基因与大肠杆菌基因的融合产物比天然真核蛋白更稳定;
③表达蛋白的纯化较为困难,但与特定的原核蛋白融合后,可以利用识别原核肽段的配
体进行亲与层析纯化。

将真核基因与谷胱甘肽硫转移酶(glutathione-S-transferase,GST)基因融合,表达的融合蛋白可用谷胱甘肽亲与柱纯化。

蛋白A(protein A)就是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白成分,能与免疫球蛋白IgG结合,将目的基因与蛋白A基因融合,产生的融合蛋白可以用偶联有IgG的琼脂糖亲与层析柱纯化。

目前许多融合表达载体已商品化,并且厂家提供的产品中通常有针对融合蛋白的原核肽段的亲与层析柱,这样可以方便地纯化得到融合蛋白;
④许多蛋白与原核蛋白融合后,能保留原有的免疫原性,而一些免疫原性弱的多肽制成
融合蛋白后,其免疫原性能得到加强,如谷胱甘肽硫转移酶具有较强的免疫原性,可增强与之融合的蛋白的免疫原性,因此,可以用融合蛋白制备抗真核蛋白的抗体。

因此,当试验了很多条件还不能使外源基因在大肠杆菌中高效表达时,融合表达可能就是最佳的选择,因为载体中启动子下游已有的基因(或部分基因序列)往往就是能高效表达的,当外源基因与其融合后,该已有的基因将带动下游的外源基因获得高效表达,而且表达产物较稳定,不易被宿主降解。

若要获得天然产物,可通过合适的蛋白酶或化学切割融合蛋白来达到目的。

二、蛋白分泌型表达
蛋白分泌型表达根据表达场所的不同分为周质分泌表达与胞外分泌表达。

1、周质分泌表达
就是通过将外源基因融合到编码原核蛋白的信号肽序列的下游而实现,当蛋白分泌到位于大肠杆菌细胞内膜与细胞外膜之间的周质时,信号肽可被信号肽酶所切割,而获得具有天然一级结构的产物。

信号肽通常由15~30个氨基酸残基组成,在N端以带正电荷的赖氨酸与精氨酸为特征,随后就是一段以顺水氨基酸为主的肽段,邻近切割位点常有几个侧链较短的氨基酸如甘氨酸、丙氨酸。

带正电荷的N端有助于新生肽段与细胞质膜结合,疏水肽段能形成α-螺旋,在信号肽序列之后的一段氨基酸残基也能形成α-螺旋,两段α-螺旋以反平行方式组合成发夹结构后,容易进入内膜的双脂层。

邻近切割位点的氨基酸倾向于形成β-折叠,
这可能就是信号肽酶识别的结构。

当然,信号肽后的氨基酸对穿膜及随后的切割也有影响。

原核生物的脂蛋白、外膜蛋白ompA与碱性磷酸酶phoA的信号肽序列常用于构建周质分泌型表达载体。

周质分泌表达有以下几个优点:
①分泌后的蛋白产物不含氨基端甲硫氨酸;
②原核生物细胞质中的还原环境不利于蛋白二硫键的形成,而氧化性的周质间隙可以
模拟真核细胞的内质网环境,便于新生肽链折叠成天然结构,从而获得安全生物活性的重组蛋白;
③一些可被细胞内蛋白酶所降解的蛋白在外周质中稳定性提高。

周质分泌亦存在一些问题,如一些含有较长疏水肽段的蛋白在穿膜时有可能滞留在质膜上,信号肽不被切割或不在特异位置切割,表达量低,仅占细菌总蛋白的0、3%~4%等。

解决的途径有:
①在信号肽酶切割位点两侧进行点突变,使之形成穿膜所需的结构,这种点突变最好在
信号肽中进行,避免改变目的蛋白的氨基酸序列;
②信号肽下游一定间隔处融合目的蛋白;
③试用不同种类的信号肽与目的蛋白融合。

2、胞外分泌表达
重组蛋白分泌到胞外可以使二硫键正确折叠,避免蛋白在胞内聚集,形成包涵体,而且还可以使重组蛋白的下游纯化较为简单,便于大规模放大处理。

目前,使异源蛋白分泌到培养基的系统主要有α-溶血素(haemolysinA,HlyA)系统与细菌素释放蛋白(bacteriocin release protein,BRP)系统。

HlyA系统就是将真核基因融合在HlyA的N端,利用HlyA能直接从胞内转运到胞外的特点,将重组蛋白分泌到培养基中。

有人将胰岛素原基因融合到金葡菌蛋白A 的基因上,构建成大肠杆菌中基因融合的胞外分泌表达载体,它能高效表达且有效地分泌表达产物,利用亲与层析能方便地从培养基中分离出融合蛋白。

融合蛋白经溴化氰裂解后,经反相HPLC分析,分离得到具有天然结构的胰岛素原。

表达蛋白的提取与纯化
一、提取
胞内表达就是原核表达的主要方式,当表达产物多以可溶性蛋白的形式存在于菌体细胞内时,破碎菌体细胞后从裂解液的上清液中即可得到目的蛋白。

但蛋白在大肠杆菌中高水平
表达时,常形成包涵体,这就是蛋白在胞内互相凝集而形成的无活性固体颗粒,具有很强的折光性。

形成包涵体的原因有:目的基因的过度表达,使蛋白无足够时间进行肽链折叠,产生凝集;各种原因引起的蛋白不能正确折叠;蛋白的性质与稳定、pH值等环境条件的影响等。

为了获得可溶性的活性蛋白,必须从细胞裂解液中分离包涵体,将其溶解后进行重新折叠。

1、包涵体的分离为了获得包涵体,常采用机械破碎菌体,也可加溶菌酶超声破菌,菌体破碎后,经洗涤、离心分离,即得包涵体。

2、包涵体的溶解通常采用变性剂。

对绝大多数包涵体而言,在pH8、0条件下,6~8mol/L 尿素或5~8mol/L盐酸胍即可将其溶解。

另外,去垢剂、有机溶剂、碱性环境(pH>9、0)也可使包涵体溶解。

如果包涵体中蛋白含2个以上二硫键,则还需要加入还原剂如2-巯基乙醇或2-巯基苏糖醇等,使二硫键处于可逆断裂状态。

3、重组蛋白的复性包涵体溶解后,结合的蛋白互相分离,呈变性状态,即所有的氢键、疏水键全被破坏,但一级结构保持完好,因此去除变性剂时,一部分蛋白可自动折叠成具有活性的正确构型,这一过程即复性。

目前复性方法主要有稀释法、透析法与层析法(或超滤)。

对于具有二硫键的重组蛋白,复性时还涉及到二硫键的正确形成。

一般空气中的氧即可使还原型半胱氨酸残基形成二硫键,也可加入微量硫化物如2-巯基乙醇、氧化型或还原型谷胱甘肽,以促进正确二硫键的形成。

今年来对蛋白折叠理论的研究认为,许多蛋白的天然构象并不就是自发的一步折叠而成,而就是在一些辅助蛋白的协助下经许多中间态逐步形成的。

包涵体的形成,就是由于肽链折叠过程中部分折叠的中间态之间的特异性错误聚合,而不就是形成成熟的天然态或完全解链的蛋白。

为克服包涵体的形成,常用的策略就是在表达目的蛋白的同时,共表达分子伴侣(chaperones)与折叠群。

分子伴侣就是细胞内催化及维持其她蛋白正确构象的一类蛋白分子,它们识别、结合与稳定部分折叠的蛋白中间体,避免不适当的分子间及分子内作用,但不催化二级结构的形成。

大肠杆菌的分子伴侣有GroES/GroEL、Dnak/DnaJ、SecB、PapD等。

与分子伴侣不同,折叠酶具有催化异构作用,限制蛋白变性速率。

氧化还原酶DsbB及肽脯氨酰异构酶(PPlase)催化大肠杆菌中x-pro肽键的异构反应。

非受体蛋白酪氨酸激酶在大肠杆菌中多形成包涵体,将酪氨酸激酶与GroES、GroEL、Dnak、DnaJ、GrpE等共表达,得到了可溶蛋白。

二、纯化
目前重组蛋白的纯化方法主要就是色谱法,如离子交换层析、疏水作用层析、凝胶过滤
层析、亲与层析等,近年来出现的径向色谱分离、灌注层析、旋转等电聚集电泳及反胶团分离等技术也得到了广泛应用。

纯化过程中,合理的色谱分离次序也很重要。

;例如,用盐酸胍溶解的包涵体不能首先使用离子交换层析;用SDS溶解的包涵体第一步分离仅限于凝胶过滤层析;用尿素溶解的包涵体则有多种选择。

此外,分离纯化所用的缓冲液的各种参数,如pH值、温度、离子强度等对生物活性的影响不易确定,一次分离纯化操作带有很大的经验成分。

三、检测
真核基因在大肠杆菌中表达产物的检测方法有以下3种:
1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 用于确定所表达的目的蛋白就是否存在以及蛋白的相对分子量与纯度。

2、Western blot 利用能与目的蛋白特异性结合的抗体进行蛋白转运印迹杂交,可确证SDS-PAGE所检出的表达产物的均一性与特异性。

3、生物活性检测生物活性的鉴定与检测就是判断真核基因就是否确实表达的最有力证据。

诱导表达的菌体在超声破碎后,通过SDS-PAGE能鉴定表达产物的存在形式,在上清液中存在的蛋白通常具有生物活性,而包涵体中存在的蛋白需变性裂解复性后方可测出生物活性。

通过上述方法可评估复性蛋白的产率,为优化表达条件提供依据,进而测定蛋白的产量。