多糖的分离和纯化

一、多糖的分离和纯化
多糖是极性极大的大分子化合物，提取时一般先将原料脱脂、脱色，然后用水、盐或稀碱水在不同温度下提取。

提取物浓缩后加沉淀剂(乙醇、丙酮等)离心沉淀，沉淀部分可反复多次离心沉淀，以除去部分水溶性色素等杂质。

1．除蛋白
用水或稀碱提取的多糖常含有蛋白质，常用的除蛋白质的方法有Sevag 法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法等。

前两种多用于微生物多糖，后者多用于植物多糖。

Sevag 法是经典的除蛋白质方法，复杂、费时，且样品损失较大。

冯建林等比较了Sevag 法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、硫酸铵法及木瓜蛋白酶复合酶法除蛋白的效果，从蛋白残留量和多糖的得率两方面评价．认为三氯乙酸法最好，但三氯乙酸仍不能完全除去蛋白，建议三氯乙酸法和Sevag 法结合使用。

2．脱色
多糖中常含有一些色素(游离色素或结合色素)，根据其不同性质采取不同的去除方
法。

常用的脱色方法有离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法(纤维素、硅藻土、高岭土、活性炭等)。

D EA E一纤维素是目前最常用的脱色方法，通过离子交换柱不仅达到脱色目的，而且可以进行多糖的分离。

H2 O2：是一种氧化脱色剂，浓度不宜过高，宜在低温下进行，否则引起多糖的降解。

对于同时含有游离蛋白质和色素的多糖，可通过生成金属络合物的方法同时除去蛋白和色素，即加入费林试剂生成不溶性络合物，经分离后用阴离子交换树脂分解络合物。

吸附脱色法也常用，如通过活性炭、高岭土、硅藻土柱达到脱色的目的。

3．多糖的分级
采用一般方法提取的多糖，通常是多糖的混合物，即是多分散性的，其不均一性表现在化学组成、聚合度、分子形状等的不同。

分级可以达到纯化的目的，可按分子大小和形状分级(如分级沉淀、超滤、分子筛、层析等)，也可按分子所带基团的性质分级(如按电荷性质分级的电泳、离子交换层析等)。

(1)分级沉淀
利用分子大小和溶解度不同进行分离，常用的有两种方法，即有机溶剂沉淀法和季
铵盐或硫酸铵法。

Ba(O H )2、Ca(O H )2等也常用于酸性多糖的分级。

(2)柱层析法
柱层析法较常用，也可分为两类。

一类是只有分子筛作用的一般凝胶柱层析，如Sephadex、Saphrose、Bio gel等；
一类是离子交换层析，这种分级不仅按电荷性质不同，同时也有分子筛作用，如带负电荷的多糖可在阴离子型的D EA E一纤维素柱或D EA E—Sephadex 柱上达到分级；酸性多糖可在阳离子型的羧甲基(CM —Sephades)或黄乙基(SE—Sephadex)等凝胶柱上分离。

这种离子交换树脂常用水、不同浓度和种类的缓冲溶液或酸碱液洗脱得以分级。

检测手段国内仍沿用经典的酚一硫酸法，国外用LKB 柱层析系统，用比旋度、视差折光及紫外检测器，各组分的峰位自动记录，分离效果好且方便。

(3)透析、超滤及超速离心
选用不同规格的超滤膜和透析袋进行超滤和透析以及一定条件下的超速离心操作，可按分子大小将多糖样品分级，超滤和透析更常用于除去小分子物质。

(4) 区带电泳
区带电泳主要按多糖的电荷性质不同分级，常用的有聚丙烯酰胺凝胶电泳、乙酸纤维素薄膜电泳。

二、纯度鉴定
1、紫外分光光度法
:将多糖P W2 加0.9 % N aCl 溶液溶解, 配成浓度为1mg·mL-1的溶液, 采用UV-160A 紫外可见光谱仪扫描(200nm-300nm)观察260nm、280nm 处是否有
吸收峰。

2、纸层析法(PC)
取0.5% 的多糖PW2 样品溶液50μL , 点样于新华中速滤纸(3cm ×20cm)距端点1cm 处的中部, 以正丁醇∶浓氨水∶水(40∶50∶5)为展开剂, 饱和2h 以上,在室温下展开6h, 取出吹干, 用0.5%甲苯胺蓝液染色, 立即用95%乙醇漂洗至背景褪色。

3、凝胶柱层析法
用DEA E-纤维素52(2.6cm ×100cm)柱层析, 0.1mol·L-1N aCl 洗脱, 流速6mL ·h-1, 按2mL 一管分部收集, 苯酚-硫酸法逐管检测, 绘制收集体积与糖含量之间的关系曲线。

4、琼脂糖(Ag aro se)凝胶电泳法
在琼脂糖板(厚度为0.2cm)上点样3 ～5μL 采用浓度为0.075mol·L-1, pH8.6 的巴比妥缓冲液, 电泳1～ 1.5h, 电压为64～80V , 甲苯胺蓝(浓度为1%)染色, 醋酸乙醇混合溶液(醋酸∶乙醇∶水=0.1∶5∶5)脱色。

P W2 多糖纯品经电泳展开。

5、红外光谱分析
取干燥样品微量, 压片, 全波段扫描。

6、核磁共振分析
将样品10mg , 溶于D2O(重水)中, 溶解温度80℃, 分别在400MHz 和500MHz 上测定1HNM R和CNM R 。

三、结构鉴定
多糖的化学研究首先是提取、分离、纯化以获得不同的多糖组分，经纯度鉴定证明为均一多糖后进行各组分的理化性质如溶解度、旋光、粘度、分子量等的测定，然后进行平面的和立体的化学研究以及结构改造和修饰的研究。

经典通用的多糖结构鉴定方法常按图 1 程序进行。

经过分级纯化的多糖在测定结构前须检查其纯度及测定分子量。

目前检查纯度最常用的判断方法主要有：
1)用G C 、H PLC测定组成多糖的单糖的摩尔比是否恒定。

用不同的柱型测定结果更为可靠。

2)电泳只出现一条带。

如可用聚丙烯酰胺凝胶电泳、乙酸纤维素薄膜电泳及玻璃纤维纸电泳。

对于中性多糖可采用高压电泳，以硼酸盐为缓冲液，可增大其迁移速度。

3)凝胶柱层析图呈现对称的单峰。

若有“拖尾”现象，说明其均一性不够好。

4)纸层析法呈单一集中斑点。

多糖的分子量测定过去用超速离心沉降法、光散射法、渗透压法、粘度法等，这些方法操作复杂且误差较大，现已少用。

现在较常用的方法有凝胶过滤法和高效凝胶液相色谱法，这两种方法须先用已知分子量的标准多糖对照测定样品的分子量。

多糖的生物大分子结构比蛋白质更为复杂，这不仅因为组成多糖的单糖品种繁多(目前已知的单糖有200 多种)，而且即使只由一种单糖组成的多糖因其连接方式的不同以及可能有的支链(蛋白质支链较少)使多糖的结构鉴定非常困难。

多糖的结构鉴定方法较多，主要分为3 大类，即化学分析法、物理分析法和生物学方法。

3．1 化学分析法
3．1．1 酸水解
阐明结构的第一步就是要鉴别多糖的单糖组分，酸水解是常用的方法，可根据需要选择适当的条件(酸的种类、浓度、温度及水解时间等)。

现在酸水解方法已实现完全自动化。

3．1．2 甲基化
甲基化法虽然不能解决多糖中单糖的连接顺序，但它对于阐明单糖的连接方式(键
型)、重复结构中某种单糖的数目、末端糖的性质以及分支点的位置等非常有用。

全甲基化的多糖一般先经90 %甲酸水解，然后用0．5 m ol／L 的硫酸或三氟乙酸水解，水解时要注意防止发生去甲基化和降解反应。

水解后的甲基化单糖混合物可用层析法分离或制成挥发性衍生物通过GC 分析。

若用G C—M S对结构解析更为方便。

3．1．3过碘酸及其盐的氧化
多糖因其有邻二醇、邻三醇结构而易被过碘酸盐氧化开环。

通过测定过碘酸盐的消耗、甲酸的生成和剩余糖的比就可确定多糖维中各种单糖的键型及其比例。

3．1．4 Sm ith 降解
用稀酸在室温下对多元醇进行部分酸水解，可得到各种赤藓醇糖苷或丙三醇糖苷，研究这些单糖苷、二糖苷和寡糖苷的结构有助于阐明多糖中单糖的部分连接顺序和键型。

3．1．5碱降解
碱降解发生在与单糖的羟基或羧基连接的酯上，多糖还原端的单糖被逐个剥落，用之可分析多糖的键型。

3．1．6 酶水解
是多糖控制降解的另一种方法，它主要是根据特定的酶降解特定结构的多糖的特性
以阐明多糖的部分结构。

3．1．7免疫化学技术
多糖是许多微生物免疫特异性的决定因子，根据多糖抗原与蛋白质抗体的多反应基的特异性，只有一定结构的多糖才能与一定类型抗体的蛋白质作用，如果能制备对抗未知多糖的抗体，那么这种抗体可用来阐明未知多糖的相似结构。

3．2物理分析法
3．2．1 IR
IR 在多糖结构分析上主要是确定吡喃糖的苷键构型以及常规观察其他官能团。

一般主要观察730～960cm-1的范围，如对于a一吡喃糖，艿δC1一H 在845 cm-1，而β吡喃糖艿C1一H在890 cm-1。

3．2．2 M S 、G C —M S
GC 分析多糖虽受样品挥发性和热稳定性的限制，但G C—M S 是多糖结构分析不可缺少的工具，特别是对水解单糖、甲基化单糖及甲基化寡聚糖的分析，而且能鉴别出糖的异构体。

M S 在糖链结构分析中，由于其方法快速灵敏、样品用量极少而得到越来越广泛的
应用。

不但在鉴定各种甲基衍生物的碎片、从而确定各种单糖残基的连接位置时必不可少，而且近年来由于快原子轰击质谱(FA M —M S)、电喷雾电离质谱(ESI—M S)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(M A LD I—M S)的出现，质谱还可以测定糖链的分子量及糖
链的一级结构。

ESI—M S 是目前最软的一种电离技术。

因其能形成多电荷离子，故能测量分子量近10 万的大分子。

ESI—M S 易和H PLC 、CE 、SFC 等技术联用，大大提高了工作效率及灵敏度和精确度。

ESI—M S 与CID 联用可得到不同的碎片离子，由此可获知低于pmol(皮摩尔，10-12摩尔)的寡糖及其复合物的分子量、连接顺序及分支等信息。

V ernon 等曾用ESI —M S 与CID 相结合的技术研究了多糖的分子量、序列、链连接及分支。

ESI—M S 因其“干净”、灵敏，还可与串联质谱(M S—M S)联用进行寡糖混合物的结构确证。

M A LDI—M S 也是一种类似ESI—M S 的软电离技术，与E SI—M S 一样，这种电离技术产生分子离子稳定、不易裂解，极适用于测定生物大分子样品，且准确度极高。

测定的分子量与分子形状无关(与层析法和电泳法不同)，所以很适合测定多糖的分子量及大小分布。

此外，M A LD I方法不受样品中的无机盐缓冲液的影响，其灵敏度也是各类方法中最高的。

M ock 用1 mol
样品在5 min 内就可获得寡糖分子量最多差0.5 的准确度。

3．2．3 N M R
用N M R 技术研究糖链结构的优点是不破坏样品，糖链的结构特征通过化学位移、偶合常数、积分面积、N O E 及驰豫时间等参数表达。

早期N M R 主要用于解决多糖结构苷键的构型以及重复结构中单糖的数目，近年来N M R 技术突飞猛进的发展为生物大分子的结构研究创造了良好的条件。

如在确定多糖的单糖组成方面，除了通过H —N M R和”C N M R 化学位移信息外，还可用H 一HCo SY 、H 一¨C Co SY 等二维谱；在确定单糖的类型和构型方面，可用H 一H DQ F—C o SY 、R C T 、T o C SY 、H o H A HA ，H ET —Co R —H M Q C 。

在确定单糖的连接位置和顺序时可用H —N M R 方法，如H —lH 远程偶合‘J} ：0cH、DIFN o E 、1D N o E—R o E 、2DN o E SY —R o E SY 、2D T o C SY —R o E SY 、3DTo CSY —R o ESY 。

可用的nC —N M R 方法，如对照已知结构的单糖或寡糖的¨C—N M R 数据、H ET Co R—H M Q C 、H M BC 、G IS 、SIN EPT 、D EP T 、A PT 、L R H 一C C o N N E C T IV IT Y和nC一{ H } N o E ，测定T (糖链中单糖的活动自由度与T 有关)等。

Paw an 等综述了一维、二维N M R 在分析糖的构型、相互连接的位置及顺序等方面的应用。

Jasson 等曾开发了一套专门用于多糖结构N M R 解析的计算机专家系统cs ，，使复杂、费时的多糖结构研究工作大为简化。

H —N M R 和C —N M R 用于多糖结构解析的技术和分析程序见图2。

组成多糖的单糖类型、环大小(呋喃环或吡喃环)及一0H 的位置情况确定多糖或寡糖的结构田2 N M R 用于多糖结构鉴定的方法与程序
3．2 ．4 C E
毛细管电泳(CE )是近几年发展起来的一种糖类分析方法。

它以快速、高效、高分辨和样品用量少等优点，越来越受到糖化学家们的重视。

CE 在多糖结构研究中主要用来测定多糖的分子量(不同质量、不同电荷的分子电泳迁移性能不同)、多糖或寡糖的组成分析、纯度鉴定、结构归属及单糖差向异构体的分离。

与寡糖的降解方法联用，通过确定寡糖降解片段的结构并根据结构优化原理还能实现寡糖的结构分析。

由于CE 具有快速、高效、高分辨和样品用量少等优点，使其对于复杂多糖的结构分析具有不可低估的价值。

它既可以对多糖进行直接分析、得到多糖微不均一性信息，又可对多糖的酶解产物进行定量和定性分析n 。

另外CE—M S 联用可以对细胞水平的极微量多糖进行精确分析。

需要说明的是，CE 方法分析结果的重现性较差，在进样方法和定量分析方面需要在技术上进一步提高。

3．3 生物学方法
生物学方法主要是酶学方法，即利用各种特异性糖苷酶水解多糖分子得到寡糖片段，再与其他定性、定量方法联用推测多糖的结构。

目前较为先进的酶学方法是试剂阵列分析法(R A A M )，由Edge 等人创立。

它是用一系列特定的外切糖苷酶的混合物对多糖或寡糖进行酶解，将酶解所得的片断分离，并通过其流体动力学体积与计算机数据库中的数据进行比较，从而大大提高了多糖结构分析的速度和精度。

另外还有一种类似固相蛋白测序的技术，它首先将多糖或寡糖固定在一个固态载体上，再依次用糖苷酶作用，对每一种外切酶酶解下来的单糖进行定性、定量分析。

由于分子生物学和分析技术的高速发展，多糖的分离和结构测定方法也取得了很大进展，糖化学家们可以利用化学、物理和生物学手段对多糖分子结构与功能进行研究，而高新技术的发展使分析手段更加快速、高效和灵敏。

Parekh 等已经成功地在pmol水平上确定了从正常人的血液单核细胞中提得仅20 g 白介素一6 样品上的寡糖序列。

相信随着糖类分子生物学的不断发展和技术进步，对超微量多糖也能进行分离和结构测定，届时将大大推动分子生物学的发展，科学家可以更直接、更有效地探索生命现象的奥秘。