分子克隆技术(1)精品PPT课件
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1）用属名的头一个字母和种名的头两个字母，组成3个字母 的略语表示寄主菌的物种名称。
如大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco 表示， 流感嗜血菌（Haemophius influenzae）用Hin表示
2) 用一个写在右方的字母代表菌株或型, 3) 如Eco R
3) 如一种寄主菌株具有几个不同的限制与修饰体系,以 罗马数字表示。
PCR amplification of your interested gene from a genome (insert)
Plasmid preparation (vector)
Genomic fragments
Restriction digestion (trimming the DNA ends)
3. 增加目的基因的剂量
（二） 基因工程的工具酶
“手术刀” “缝纫针” “复印机” “搬运工”
方
专司切割之职 具有连接之功 行使复制之责 胸藏末端转移之
内切酶
连接酶 聚合酶 转移酶
限制性核酸内切酶
Ⅰ ⅡⅢ
• Ⅱ 型限制性核酸内切酶： 识别与切割DNA链上同一特异性核苷酸序列；
识别序列具180℃旋转序列（回文序列）； 识别序列一般是4－8个碱基（4个以下很少）。
• 对双链DNA同时切割，产生不同的切口:
1）形成平头末端（ blunting ends）
2）形成5ˊ 粘性末端（Cohesive ends）
3）形成3ˊ粘性末端
+ 5’-CCCGGG-3’SmaI 5’-CCC-OH p -GGG-3’
3’-GGGCCC-5’
3’-GGG- p
OH-CCC-5’
4) 如大肠杆菌分别表示EcoR I, EcoR II
核酸外切酶
从DNA链的一头开始按序催化降解核苷酸的酶。 按3‘-5’方向催化单链或双链DNA，自3‘-OH末端释 放5’-单核苷酸。
应用：
通过3‘-5’活性使双链DNA分子产生出单链区，可 作为DNA标记的引物，制备特异放射性探针。
DNA连接酶
第九章
分子克隆技术—
（1）工具酶和载体
（一） 分子克隆（molecular clone）
克隆的概念： 作名词用 作动词用
遗传相似的群体 无性繁殖
分子克隆的概念：
在分子水平上，使一个独特的DNA序列在细 胞中进行复制和表达。
分子克隆同义概念：
• DNA重组技术 (recombinant DNA technique) • 基因克隆（gene cloning） • 基因操作（gene manipulation） • 基因工程（gene engineering） • 遗传工程（genetic engineering）
催化两条DNA单链相邻碱基之间形成磷酸二酯键。 封闭DNA之间的缺口（nick），即双链DNA的某一 条链上两个相邻核苷酸间失去一个磷酸二酯键出现 的单链断裂；
不能封闭裂口（gap），即双链DNA的某一链上失去 一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。
作用:
催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成 重组DNA分子。
3’ OH
载体多克隆 位点
限制性内切酶酶切
3‘OH 5’P
CIAP去除5‘磷酸
3’ OH5’OH
转化E.Coli
筛选重组子，测序
载体的发展概况：
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如 pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al)
用 途：制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA 探针。
（三） 基因工程的载体
载体 （Vector ）
将外源DNA片段带入宿主细胞并进行 复制或表达的运载工具。
载体设计和应用是DNA体外重组的重要环节。
外源DNA
5‘P 3‘OH
限制性内切酶酶切
3‘OH 5’P
5’P 3‘OH
T4连接酶连接
5’OH
按来源分：
1）原核生物载体：
质粒载体 λ噬菌体载体 M13噬菌体载体 cosmid（粘粒ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ载体 Phagemid（噬菌粒）载体
2）真核病毒载体
载体的基本特征：
• 在宿主细胞中能够自主复制；
分子克隆过程：
将生物某个有利基因从其基因组中取下来，与另一 个载体DNA缝合成为重组DNA。然后，把这个重组 DNA安置到一个受体细胞中，使其安家落户。这个基因 在载体DNA的带动之下，繁衍生息，生产出需要的基因 工程产品。
DNA Cloning: a simplified flow chart
平末端
5ˊ粘性末端
3ˊ粘性末端
• 同裂酶（isoschizomers)
来源不同，但识别同样的核苷酸靶序列； 产生同样的切割，形成同样的末端。
• 同尾酶（isocandamers)
来源不同，识别不同核苷酸靶序列； 但形成同样的末端。
• 核酸内切酶的命名法（Smith H.O & Nathans D. 1973）
2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点 区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同 要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表 达型载体及各种探针型载体。
载体的分类 按用途分：
克隆载体 （cloning Vector ） 表达载体 （expression Vector ） 整合载体 （ integration Vector ）
粘性末端DNA片段的连接：容易
平末端DNA片段的连接：比较困难
DNA聚合酶 Pol I Pol II Pol III
Pol II 催化合成DNA的互补链; 在生长链的3‘－OH末端同渗进来的核苷酸发生聚合反应。
具备条件：
四种脱氧核苷酸dNTPs (dATP dGTP dCTP dTTP )； 带有3‘－OH游离基团的引物链； DNA模板
Ligation (join the insert and the vector)
Transformation (introduce the plasmids into host cells)
Assay of the recombinants
分子克隆的特点：
1. 打破物种界限，不同种类生物的遗传物质组合 在一起 2. 可以定向的改变生物的遗传特性
如大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco 表示， 流感嗜血菌（Haemophius influenzae）用Hin表示
2) 用一个写在右方的字母代表菌株或型, 3) 如Eco R
3) 如一种寄主菌株具有几个不同的限制与修饰体系,以 罗马数字表示。
PCR amplification of your interested gene from a genome (insert)
Plasmid preparation (vector)
Genomic fragments
Restriction digestion (trimming the DNA ends)
3. 增加目的基因的剂量
（二） 基因工程的工具酶
“手术刀” “缝纫针” “复印机” “搬运工”
方
专司切割之职 具有连接之功 行使复制之责 胸藏末端转移之
内切酶
连接酶 聚合酶 转移酶
限制性核酸内切酶
Ⅰ ⅡⅢ
• Ⅱ 型限制性核酸内切酶： 识别与切割DNA链上同一特异性核苷酸序列；
识别序列具180℃旋转序列（回文序列）； 识别序列一般是4－8个碱基（4个以下很少）。
• 对双链DNA同时切割，产生不同的切口:
1）形成平头末端（ blunting ends）
2）形成5ˊ 粘性末端（Cohesive ends）
3）形成3ˊ粘性末端
+ 5’-CCCGGG-3’SmaI 5’-CCC-OH p -GGG-3’
3’-GGGCCC-5’
3’-GGG- p
OH-CCC-5’
4) 如大肠杆菌分别表示EcoR I, EcoR II
核酸外切酶
从DNA链的一头开始按序催化降解核苷酸的酶。 按3‘-5’方向催化单链或双链DNA，自3‘-OH末端释 放5’-单核苷酸。
应用：
通过3‘-5’活性使双链DNA分子产生出单链区，可 作为DNA标记的引物，制备特异放射性探针。
DNA连接酶
第九章
分子克隆技术—
（1）工具酶和载体
（一） 分子克隆（molecular clone）
克隆的概念： 作名词用 作动词用
遗传相似的群体 无性繁殖
分子克隆的概念：
在分子水平上，使一个独特的DNA序列在细 胞中进行复制和表达。
分子克隆同义概念：
• DNA重组技术 (recombinant DNA technique) • 基因克隆（gene cloning） • 基因操作（gene manipulation） • 基因工程（gene engineering） • 遗传工程（genetic engineering）
催化两条DNA单链相邻碱基之间形成磷酸二酯键。 封闭DNA之间的缺口（nick），即双链DNA的某一 条链上两个相邻核苷酸间失去一个磷酸二酯键出现 的单链断裂；
不能封闭裂口（gap），即双链DNA的某一链上失去 一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。
作用:
催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成 重组DNA分子。
3’ OH
载体多克隆 位点
限制性内切酶酶切
3‘OH 5’P
CIAP去除5‘磷酸
3’ OH5’OH
转化E.Coli
筛选重组子，测序
载体的发展概况：
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如 pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al)
用 途：制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA 探针。
（三） 基因工程的载体
载体 （Vector ）
将外源DNA片段带入宿主细胞并进行 复制或表达的运载工具。
载体设计和应用是DNA体外重组的重要环节。
外源DNA
5‘P 3‘OH
限制性内切酶酶切
3‘OH 5’P
5’P 3‘OH
T4连接酶连接
5’OH
按来源分：
1）原核生物载体：
质粒载体 λ噬菌体载体 M13噬菌体载体 cosmid（粘粒ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ载体 Phagemid（噬菌粒）载体
2）真核病毒载体
载体的基本特征：
• 在宿主细胞中能够自主复制；
分子克隆过程：
将生物某个有利基因从其基因组中取下来，与另一 个载体DNA缝合成为重组DNA。然后，把这个重组 DNA安置到一个受体细胞中，使其安家落户。这个基因 在载体DNA的带动之下，繁衍生息，生产出需要的基因 工程产品。
DNA Cloning: a simplified flow chart
平末端
5ˊ粘性末端
3ˊ粘性末端
• 同裂酶（isoschizomers)
来源不同，但识别同样的核苷酸靶序列； 产生同样的切割，形成同样的末端。
• 同尾酶（isocandamers)
来源不同，识别不同核苷酸靶序列； 但形成同样的末端。
• 核酸内切酶的命名法（Smith H.O & Nathans D. 1973）
2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点 区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同 要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表 达型载体及各种探针型载体。
载体的分类 按用途分：
克隆载体 （cloning Vector ） 表达载体 （expression Vector ） 整合载体 （ integration Vector ）
粘性末端DNA片段的连接：容易
平末端DNA片段的连接：比较困难
DNA聚合酶 Pol I Pol II Pol III
Pol II 催化合成DNA的互补链; 在生长链的3‘－OH末端同渗进来的核苷酸发生聚合反应。
具备条件：
四种脱氧核苷酸dNTPs (dATP dGTP dCTP dTTP )； 带有3‘－OH游离基团的引物链； DNA模板
Ligation (join the insert and the vector)
Transformation (introduce the plasmids into host cells)
Assay of the recombinants
分子克隆的特点：
1. 打破物种界限，不同种类生物的遗传物质组合 在一起 2. 可以定向的改变生物的遗传特性