猪瘟诊断技术

三、病理变化

急性和亚急性猪瘟病变以多发性出血为 特征。淋巴结水肿、出血，呈现大理石 病变。肾脏呈土黄色，皮质表面可见针 尖状出血点。全身浆膜、粘膜和心脏、 膀胱、胆囊均可见出血点和出血斑，脾 脏边缘出现梗死灶。慢性猪瘟在回肠末 端、盲肠和结肠常见特征性的纽扣状溃 疡。
四、实验室诊断
（一）样品采集、包装与运输按照 《兽 医实验室生物安全技术管理规范》执行。 （二）病原分离鉴定
二、临床症状
本病潜伏期一般为3-5天，最长可达30天， 隐性感染可长期带毒。 本病可分为急性、亚急性、慢性和隐性 感染四种类型。


急性猪瘟 发病快，体温通常升至41℃ 以上。结膜炎、厌食、畏寒、先便秘后 腹泻等症状。数天后，腹部皮下、鼻镜、 耳尖、四肢内侧均可出现紫色出血斑点， 指压不褪色，眼结膜和口腔粘膜可见出 血点。死亡率高达90%，大多在1-2周内 死亡。

2、猪瘟荧光抗体染色法

荧光抗体染色法快速、特异，可用于检 测扁桃体等组织样品以及细胞培养中的 病毒抗原。操作程序如下：
1 样品的采集和选择 活体采样：利用扁桃体采样器（鼻捻子、 开口器和采样枪）。采样器使用前均须 用 5% 氢氧化钠溶液消毒后经清水冲洗。 首先固定活猪的上唇，用开口器打开口 腔，用采样枪采取扁桃体样品，用灭菌 牙签挑至灭菌离心管并作标记。 其它样品：剖检时采取的病死猪脏器， 如扁桃体、肾脏、脾脏、淋巴结、肝脏 和肺等脏器，或病毒分离时待检的细胞 玻片。 样品采集、包装与运输按《兽医实验室 生物安全技术管理规范》执行。
亚急性猪瘟 症状类似急性型，但较轻。 慢性猪瘟 主要表现为皮肤出血斑点和 耳尖坏死。病猪食欲减退，生长停滞和 贫血，出现周期性发热和腹泻，病程通 常在1个月以上，病猪难以完全康复，常 成为僵猪。


隐性猪瘟 通常由病毒持续性感染发展 而成。可持续数月甚至更长时间而不表 现症状。母猪大多表现繁殖障碍。，产 下的带毒仔猪通常发生先天性感染和免 疫耐受。
三、试剂
（一）试剂组成 阳性对照700ul；A液：变性液7ml B液：醋酸钠溶液350ul C液：酚/氯仿/异戊醇混合液3.5ml D液：异丙醇3.5ml ；E液：70%乙醇12ml F液：DEPC处理的灭菌去离子水900ul G液：RNA酶抑制剂15ul；H液：RT-PCR反应液250ul I液：反转录酶3ul；K液：TaqDNA聚合酶12ul L液：矿物油300ul M液：50倍TAE电泳缓冲液20ml N液：溴化乙锭溶液200ul O液：上样缓冲液50ul

Hale Waihona Puke （二）耗材：眼科剪、眼科镊、称量纸、 20ml一次性注射器、1.5ml经焦碳酸二乙 酯（DEPC）水处理的灭菌离心管、琼脂 糖、500ml量筒、500ml锥形瓶、吸头 （10ul、200ul、1000ul）、灭菌双蒸水。
五、注意事项
（一）所有接触CSFV病料的物品均应合理 处理，以免污染试验室。 （ 二 ） PCR 整 个 试 验 分 PCR 反 应 液 配 制 区 — 配液区、模板提取区、基因扩增区、 电泳区。流程顺序为配液区 模板提取 区 基因扩增区 电泳区。严禁器材和 试剂导流。 （三）所有试剂应在规定的温度贮存， 使用时拿到室温下，使用后立即放回。
（三）电泳
称4g琼脂糖放于500ml锥形瓶中，加入50倍 稀释的M液200ml（取4ml M液，用双蒸水 稀释至200ml），于微波炉中溶解，在加 入20ul N液混匀。在电泳槽内放好梳子， 倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产 物15ul混合3ul O液，点样于琼脂糖凝胶 孔中，以5V/cm电压于50倍稀释的M液中 电泳，紫外灯下观察结果。
（四）N液具有致癌性，小心操作。 （五）注意防止试剂盒组分受污染。使用前将 红帽管5000rpm离心15s，使液体全部沉于管底。 （六）不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒 之间的成分不要混用。 （七）在RNA提取过程中，避免RNA酶污染， 尽量缩短操作时间。 （八）严格遵守操作说明可以获得最好的结果。 操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。
七、操作步骤
（一）病毒RNA提取 （二）RT-PCR操作程序 （三）电泳
（一）病毒RNA提取
1、取已处理的待检样品，每管依次加入B液30ul 、C液300ul（用C液之前不要晃动，不要吸到C 液上层保护液），颠倒10次，混匀，冰浴 15min，4℃10000rpm离心15min。 2、取300ul上清置于新的DEPC水处理过（进口离 心管已用 DEPC 水处理过） 1.5ml 灭菌离心管中， 进入300ul D液，混匀，置液氮3min或-70℃冰 箱中 30min。室温融化，台式冷冻高速离心机 中4℃15000rpm离心20min。 3、弃上清，沿管壁缓缓滴入1ml E液，轻轻旋转 一周后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1min， 真空抽干15min（以无乙醇味为准）。 4、用9ul F液和1ul G液溶解沉淀。-20℃贮存备 用。
4、 兔体交互免疫试验
本方法用于检测疑似猪瘟病料中的猪瘟 病毒。 1 试验动物 家兔 1.5—2公斤、体温 波动不大的的大耳白兔，并在试验前1天 测基础体温。


2 试验操作方法 将病猪的淋巴结和脾 脏，磨碎后用生理盐水作1：10稀释，对 3只健康家兔作肌肉注射，5毫升/只，另 设3只不注射病料的对照兔，间隔5d对所 有家兔静脉注射1:20的猪瘟兔化病毒 （淋巴脾脏毒），1毫升/只，24h后，每 隔6h测体温一次，连续测96h，对照组 2/3出现定型热或轻型热，试验成立。
一、用途 二、原理 三、试剂 四、器材 五、注意事项 六、样品制备 七、操作步骤 八、结果判定

一、用途

猪瘟病毒（CSFV）反转录聚合酶反应 （RT-PCR），用于检测疑似感染动物的 血清或组织中的CSFV的检测、诊断和流 行病学调查。该试剂盒不能用于区分区 分强弱毒。
（二）RT-PCR操作程序
每份总体积25ul。取21.5ul H液（用 前混匀）、0.3ul G液、0.2ul I液、1ul K液、2ul样品RNA。混匀并做好标记，加 入L液20ul覆盖，在PCR扩增仪上进行以 下循环：42℃ 45min，94℃ 3min，扩增 条件为94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s ；35个循环后，72℃延伸7min。
八、结果判定
在阳性对照出现272bp扩增带、阴性对 照无带出现（引物带除外）时，试验结 果成立。被检样品出现272bp扩增带为猪 瘟病毒阳性，否则为阴性。
（三）抗体检测
荧光抗体病毒中和试验 本方法是国际贸易指定的猪瘟抗体检 测方法。该试验在采用固定病毒稀释血 清的方法。测定的结果表示待检血清中 抗体的中和效价。
二、原理

利用异硫氰酸胍提取RNA，在反转录酶的 作用下，以RNA为模板，以引物为起点合 成与RNA 模板互补的cDNA链。在TaqDNA 聚合酶的作用下，经高温变性、低温退 火、中温延伸的循环，使特异DNA片段的 拷贝数放大一倍。结果35个循环，最终 使扩增DNA 片段放达了数百万倍。将扩 增DNA片段进行电泳，经溴化乙锭染色后， 在紫外灯照射下，肉眼可见到DNA片段的 扩增带。

2 检测方法与判定 方法 将上述组织制成冰冻切片，或待 检的细胞培养片（见附件一），将液体 吸干后经冷丙酮固定5－10分钟，晾干。 滴加猪瘟荧光抗体覆盖于切片或细胞片 表面，置湿盒中 37 ℃作用至少 30 分钟。 然后用PBS液洗涤，自然干燥。用碳酸缓 冲 甘 油 （ pH9.0—9.5，0.5 mol/ 升 ） 封 片，置荧光显微镜下观察。必要时设立 抑制试验染色片，以鉴定荧光的特异性。


（二）试剂贮藏条件：A、B、C、D、F、 L、M、N、O液于4℃-8℃保存，其他试剂 -20℃保存。
四、器材
试剂盒内配备 0.2ml薄壁 PCR 管 15 个。其 他需要自备的仪器设备有： （一）仪器：分析天平、台式低温高速 离心机、真空干燥器、制冰机、 PCR 仪、 电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪、液 氮或-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、2 0 ℃ 冰 箱 、 可 调 移 液 器 （ 2 ul、20ul、 200ul、1000ul）。
一、流行特点

猪是本病唯一的自然宿主，发病猪和带毒猪是 本病的传染源，不同年龄、性别、品种的猪均 易感。一年四季均可发生。感染猪在发病前即 能通过分泌物和排泄物排毒，并持续整个病程。 与感染猪直接接触是本病传播的主要方式，病 毒也可通过精液、胚胎、猪肉和泔水等传播， 人、其它动物如老鼠和昆虫、器具在本病的机 械性传播中起到重要作用。持续性感染母猪在 怀孕期可通过胎盘将病毒传播给胎儿，导致新 生仔猪发病或产生免疫耐受。
3 试验结果判定 兔体交叉免疫试验结果判定

接种病料后体温 接种猪瘟兔化弱 反应 毒后体温反应 + + -
结果判定
含猪瘟病毒 不含猪瘟病毒 含猪瘟兔化病毒
+
+
含非猪瘟病毒热 原性物质

注：“+”表示多于或等于三分之二的动 物有反应。
5、猪瘟病毒RT-PCR试验 （北京世纪元亨生产的诊断试 剂盒）


判定 在荧光显微镜下，见切片或细胞 培养物（细胞盖片）中有胞浆荧光，并 由抑制试验证明为特异的荧光，判猪瘟 阳性；无荧光判为阴性

荧光抑制试验 将两组猪瘟感染猪的扁桃体冰 冻切片，分别滴加猪瘟高免血清和健康猪血清 （猪瘟中和抗体阴性），在湿盒中37℃作用30 分钟，用生理盐水或PBS(pH7.2)漂洗2次，然 后进行荧光抗体染色。经用猪瘟高免血清处理 的扁桃体切片，隐窝上皮细胞不应出现荧光， 或荧光显著减弱；而用阴性血清处理的切片， 隐窝上皮细胞仍出现明亮的鹅黄绿色荧光。
猪瘟诊断技术
猪瘟诊断技术
根据本病的流行特点、临床特征和病理变化 可作出初步诊断，确诊需做病原分离鉴定。






一、流行特点 二、临床症状 三、病理变化 四、实验室诊断 （一）样品采集、包装与运输按照 （二）病原分离鉴定 1、细胞培养法 2、猪瘟荧光抗体染色法 3、抗原捕获-ElISA试验 4、 兔体交互免疫试验 5、RT-PCR试验 （三）抗体检测 1 、猪瘟单克隆抗体酶联免疫吸附试验（ ElISA） 2 、 荧光抗体病毒中和试验 3、猪瘟中和试验方法；4、正向间接血凝试验
（九）本试剂盒为10头份，应在3次以内用 完。
六、样品制备
（一）样品的采集 病死或扑杀的猪，取扁桃体、淋巴结等组 织病变部位与健康部交界组织；待检活 猪，用注射器取血5ml，4℃保存，送试 验室检测。（要求病料新鲜，严禁反复 冻融病料）。
（二）病料的处理：每份样品分别处理。 1、组织样品处理：称取待检病料0.05g置研磨器 中剪碎并研磨，加入600ulA液继续研磨。取已 研磨好的待检病料上清 200ul 和 200ulA 液，置 1.5ml灭菌离心管中。 2 、全血样品处理：待血凝后取上清 200ul，置 1.5ml灭菌离心管中，加入200ulA液，混匀。 3 、阳性对照处理：取 200ul，置 1.5ml 灭菌离心 管中，加入200ulA液，混匀。 4、阴性对照处理：取F液200ul，置1.5ml灭菌离 心管中，加入200ulA液，混匀。