猪瘟诊断技术

七、操作步骤
（一）病毒RNA提取 （二）RT-PCR操作程序 （三）电泳
（一）病毒RNA提取
1、取已处理的待检样品，每管依次加入B液30ul 、C液300ul（用C液之前不要晃动，不要吸到C 液上层保护液），颠倒10次，混匀，冰浴 15min，4℃10000rpm离心15min。 2、取300ul上清置于新的DEPC水处理过（进口离 心管已用 DEPC 水处理过） 1.5ml 灭菌离心管中， 进入300ul D液，混匀，置液氮3min或-70℃冰 箱中 30min。室温融化，台式冷冻高速离心机 中4℃15000rpm离心20min。 3、弃上清，沿管壁缓缓滴入1ml E液，轻轻旋转 一周后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1min， 真空抽干15min（以无乙醇味为准）。 4、用9ul F液和1ul G液溶解沉淀。-20℃贮存备 用。
3 试验结果判定 兔体交叉免疫试验结果判定

接种病料后体温 接种猪瘟兔化弱 反应 毒后体温反应 + + -
结果判定
含猪瘟病毒 不含猪瘟病毒 含猪瘟兔化病毒
+
+
含非猪瘟病毒wenku.baidu.com 原性物质

注：“+”表示多于或等于三分之二的动 物有反应。
5、猪瘟病毒RT-PCR试验 （北京世纪元亨生产的诊断试 剂盒）
（九）本试剂盒为10头份，应在3次以内用 完。
六、样品制备
（一）样品的采集 病死或扑杀的猪，取扁桃体、淋巴结等组 织病变部位与健康部交界组织；待检活 猪，用注射器取血5ml，4℃保存，送试 验室检测。（要求病料新鲜，严禁反复 冻融病料）。
（二）病料的处理：每份样品分别处理。 1、组织样品处理：称取待检病料0.05g置研磨器 中剪碎并研磨，加入600ulA液继续研磨。取已 研磨好的待检病料上清 200ul 和 200ulA 液，置 1.5ml灭菌离心管中。 2 、全血样品处理：待血凝后取上清 200ul，置 1.5ml灭菌离心管中，加入200ulA液，混匀。 3 、阳性对照处理：取 200ul，置 1.5ml 灭菌离心 管中，加入200ulA液，混匀。 4、阴性对照处理：取F液200ul，置1.5ml灭菌离 心管中，加入200ulA液，混匀。
（四）N液具有致癌性，小心操作。 （五）注意防止试剂盒组分受污染。使用前将 红帽管5000rpm离心15s，使液体全部沉于管底。 （六）不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒 之间的成分不要混用。 （七）在RNA提取过程中，避免RNA酶污染， 尽量缩短操作时间。 （八）严格遵守操作说明可以获得最好的结果。 操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。
一、流行特点

猪是本病唯一的自然宿主，发病猪和带毒猪是 本病的传染源，不同年龄、性别、品种的猪均 易感。一年四季均可发生。感染猪在发病前即 能通过分泌物和排泄物排毒，并持续整个病程。 与感染猪直接接触是本病传播的主要方式，病 毒也可通过精液、胚胎、猪肉和泔水等传播， 人、其它动物如老鼠和昆虫、器具在本病的机 械性传播中起到重要作用。持续性感染母猪在 怀孕期可通过胎盘将病毒传播给胎儿，导致新 生仔猪发病或产生免疫耐受。
八、结果判定
在阳性对照出现272bp扩增带、阴性对 照无带出现（引物带除外）时，试验结 果成立。被检样品出现272bp扩增带为猪 瘟病毒阳性，否则为阴性。
（三）抗体检测
荧光抗体病毒中和试验 本方法是国际贸易指定的猪瘟抗体检 测方法。该试验在采用固定病毒稀释血 清的方法。测定的结果表示待检血清中 抗体的中和效价。
三、病理变化

急性和亚急性猪瘟病变以多发性出血为 特征。淋巴结水肿、出血，呈现大理石 病变。肾脏呈土黄色，皮质表面可见针 尖状出血点。全身浆膜、粘膜和心脏、 膀胱、胆囊均可见出血点和出血斑，脾 脏边缘出现梗死灶。慢性猪瘟在回肠末 端、盲肠和结肠常见特征性的纽扣状溃 疡。
四、实验室诊断
（一）样品采集、包装与运输按照 《兽 医实验室生物安全技术管理规范》执行。 （二）病原分离鉴定

2、猪瘟荧光抗体染色法

荧光抗体染色法快速、特异，可用于检 测扁桃体等组织样品以及细胞培养中的 病毒抗原。操作程序如下：
1 样品的采集和选择 活体采样：利用扁桃体采样器（鼻捻子、 开口器和采样枪）。采样器使用前均须 用 5% 氢氧化钠溶液消毒后经清水冲洗。 首先固定活猪的上唇，用开口器打开口 腔，用采样枪采取扁桃体样品，用灭菌 牙签挑至灭菌离心管并作标记。 其它样品：剖检时采取的病死猪脏器， 如扁桃体、肾脏、脾脏、淋巴结、肝脏 和肺等脏器，或病毒分离时待检的细胞 玻片。 样品采集、包装与运输按《兽医实验室 生物安全技术管理规范》执行。
三、试剂
（一）试剂组成 阳性对照700ul；A液：变性液7ml B液：醋酸钠溶液350ul C液：酚/氯仿/异戊醇混合液3.5ml D液：异丙醇3.5ml ；E液：70%乙醇12ml F液：DEPC处理的灭菌去离子水900ul G液：RNA酶抑制剂15ul；H液：RT-PCR反应液250ul I液：反转录酶3ul；K液：TaqDNA聚合酶12ul L液：矿物油300ul M液：50倍TAE电泳缓冲液20ml N液：溴化乙锭溶液200ul O液：上样缓冲液50ul
猪瘟诊断技术
猪瘟诊断技术
根据本病的流行特点、临床特征和病理变化 可作出初步诊断，确诊需做病原分离鉴定。






一、流行特点 二、临床症状 三、病理变化 四、实验室诊断 （一）样品采集、包装与运输按照 （二）病原分离鉴定 1、细胞培养法 2、猪瘟荧光抗体染色法 3、抗原捕获-ElISA试验 4、 兔体交互免疫试验 5、RT-PCR试验 （三）抗体检测 1 、猪瘟单克隆抗体酶联免疫吸附试验（ ElISA） 2 、 荧光抗体病毒中和试验 3、猪瘟中和试验方法；4、正向间接血凝试验
（三）电泳
称4g琼脂糖放于500ml锥形瓶中，加入50倍 稀释的M液200ml（取4ml M液，用双蒸水 稀释至200ml），于微波炉中溶解，在加 入20ul N液混匀。在电泳槽内放好梳子， 倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产 物15ul混合3ul O液，点样于琼脂糖凝胶 孔中，以5V/cm电压于50倍稀释的M液中 电泳，紫外灯下观察结果。
4、 兔体交互免疫试验
本方法用于检测疑似猪瘟病料中的猪瘟 病毒。 1 试验动物 家兔 1.5—2公斤、体温 波动不大的的大耳白兔，并在试验前1天 测基础体温。


2 试验操作方法 将病猪的淋巴结和脾 脏，磨碎后用生理盐水作1：10稀释，对 3只健康家兔作肌肉注射，5毫升/只，另 设3只不注射病料的对照兔，间隔5d对所 有家兔静脉注射1:20的猪瘟兔化病毒 （淋巴脾脏毒），1毫升/只，24h后，每 隔6h测体温一次，连续测96h，对照组 2/3出现定型热或轻型热，试验成立。


（二）耗材：眼科剪、眼科镊、称量纸、 20ml一次性注射器、1.5ml经焦碳酸二乙 酯（DEPC）水处理的灭菌离心管、琼脂 糖、500ml量筒、500ml锥形瓶、吸头 （10ul、200ul、1000ul）、灭菌双蒸水。
五、注意事项
（一）所有接触CSFV病料的物品均应合理 处理，以免污染试验室。 （ 二 ） PCR 整 个 试 验 分 PCR 反 应 液 配 制 区 — 配液区、模板提取区、基因扩增区、 电泳区。流程顺序为配液区 模板提取 区 基因扩增区 电泳区。严禁器材和 试剂导流。 （三）所有试剂应在规定的温度贮存， 使用时拿到室温下，使用后立即放回。
（二）RT-PCR操作程序
每份总体积25ul。取21.5ul H液（用 前混匀）、0.3ul G液、0.2ul I液、1ul K液、2ul样品RNA。混匀并做好标记，加 入L液20ul覆盖，在PCR扩增仪上进行以 下循环：42℃ 45min，94℃ 3min，扩增 条件为94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s ；35个循环后，72℃延伸7min。
亚急性猪瘟 症状类似急性型，但较轻。 慢性猪瘟 主要表现为皮肤出血斑点和 耳尖坏死。病猪食欲减退，生长停滞和 贫血，出现周期性发热和腹泻，病程通 常在1个月以上，病猪难以完全康复，常 成为僵猪。


隐性猪瘟 通常由病毒持续性感染发展 而成。可持续数月甚至更长时间而不表 现症状。母猪大多表现繁殖障碍。，产 下的带毒仔猪通常发生先天性感染和免 疫耐受。
一、用途 二、原理 三、试剂 四、器材 五、注意事项 六、样品制备 七、操作步骤 八、结果判定

一、用途

猪瘟病毒（CSFV）反转录聚合酶反应 （RT-PCR），用于检测疑似感染动物的 血清或组织中的CSFV的检测、诊断和流 行病学调查。该试剂盒不能用于区分区 分强弱毒。


（二）试剂贮藏条件：A、B、C、D、F、 L、M、N、O液于4℃-8℃保存，其他试剂 -20℃保存。
四、器材
试剂盒内配备 0.2ml薄壁 PCR 管 15 个。其 他需要自备的仪器设备有： （一）仪器：分析天平、台式低温高速 离心机、真空干燥器、制冰机、 PCR 仪、 电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪、液 氮或-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、2 0 ℃ 冰 箱 、 可 调 移 液 器 （ 2 ul、20ul、 200ul、1000ul）。
二、原理

利用异硫氰酸胍提取RNA，在反转录酶的 作用下，以RNA为模板，以引物为起点合 成与RNA 模板互补的cDNA链。在TaqDNA 聚合酶的作用下，经高温变性、低温退 火、中温延伸的循环，使特异DNA片段的 拷贝数放大一倍。结果35个循环，最终 使扩增DNA 片段放达了数百万倍。将扩 增DNA片段进行电泳，经溴化乙锭染色后， 在紫外灯照射下，肉眼可见到DNA片段的 扩增带。
二、临床症状
本病潜伏期一般为3-5天，最长可达30天， 隐性感染可长期带毒。 本病可分为急性、亚急性、慢性和隐性 感染四种类型。


急性猪瘟 发病快，体温通常升至41℃ 以上。结膜炎、厌食、畏寒、先便秘后 腹泻等症状。数天后，腹部皮下、鼻镜、 耳尖、四肢内侧均可出现紫色出血斑点， 指压不褪色，眼结膜和口腔粘膜可见出 血点。死亡率高达90%，大多在1-2周内 死亡。


判定 在荧光显微镜下，见切片或细胞 培养物（细胞盖片）中有胞浆荧光，并 由抑制试验证明为特异的荧光，判猪瘟 阳性；无荧光判为阴性

荧光抑制试验 将两组猪瘟感染猪的扁桃体冰 冻切片，分别滴加猪瘟高免血清和健康猪血清 （猪瘟中和抗体阴性），在湿盒中37℃作用30 分钟，用生理盐水或PBS(pH7.2)漂洗2次，然 后进行荧光抗体染色。经用猪瘟高免血清处理 的扁桃体切片，隐窝上皮细胞不应出现荧光， 或荧光显著减弱；而用阴性血清处理的切片， 隐窝上皮细胞仍出现明亮的鹅黄绿色荧光。

2 检测方法与判定 方法 将上述组织制成冰冻切片，或待 检的细胞培养片（见附件一），将液体 吸干后经冷丙酮固定5－10分钟，晾干。 滴加猪瘟荧光抗体覆盖于切片或细胞片 表面，置湿盒中 37 ℃作用至少 30 分钟。 然后用PBS液洗涤，自然干燥。用碳酸缓 冲 甘 油 （ pH9.0—9.5，0.5 mol/ 升 ） 封 片，置荧光显微镜下观察。必要时设立 抑制试验染色片，以鉴定荧光的特异性。