酶标记物的制备

1、HRP标记腹水单抗
过碘酸钠氧化法，HRP直接标记腹水中的单抗
1、5mg HRP溶解于0.5ml 0.1M NaHCO3中； 2、加0.5ml10mM NaIO4，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2h； 3、加0.75ml 0.1M Na2CO3，混匀； 4、加0.75ml 小鼠腹水单抗，混匀； 5、加Sephadex G25干粉0.5g，混匀，盖紧，室温作用3h； 6、用少许PBS将交联物转移于一支下口具玻璃棉的5ml注射器 外筒中； 7、用少许PBS将交联物全部洗出； 8、收集洗出液，加1/20V新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀 ，室温作用30min； 9、再加3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1h；
戊二醛 二步法
马来酰 亚胺法
酶和抗体/抗原先后分别加入戊二醛溶液 中
双功能交联剂PDM通过酶和抗体/抗原中 巯基将两者偶联起来
5～25%
高
异双功 能基团 交联法
异双功能基团交联剂HECCM分别通过其 85% 羟琥珀酰亚胺基和马来酰亚胺基与酶和抗 体/抗原上游离氨基和巯基结合
（一）过碘酸盐氧化法
原理： HRP是一种糖蛋白,糖链部分无活性，其己
4℃放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应。 6、装入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2 PBS，4℃透析过夜， 或通过Sephadex G-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第1 峰洗脱液。
本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点：酶的利用率低，
一般只有2～4％的酶与蛋白质结合。
三、标记抗体质量判定
高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。
HRP酶促反应
酶促反应的过程： HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。目前用 得较广泛和较满意的供氢体是：OPD和TMB。另外 ，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基 苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，灵敏度和稳定性均好。 由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶 促反应中使用的H2O2不能过量。
10、将交联物过Sephdex G200（2.6×100cm）层析纯化，
分管收集第一峰。
Fig 2-1. Gel filtration of the reaction mixture of HRP conjugated to mAb 13A4 on a Sephadex G200 column（2.6cm×100cm）, equilibrated with PBS, at a rate of 0.15 ml/min and a tube/15 min.
3、将5mg抗体IgG溶于1mL0.15mol/L NaCl，再与醛化HRP
溶液（10mg/mL）混合。
4、加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液（调节pH至9.0～ 9.6），4℃，电磁搅拌下结合24h。
5、加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸（0.29g溶于10mL蒸馏水），
四、标记抗体保存
加等量甘油后，小量分装-20℃存放
加等量60%甘油4℃保存
以BSA或脱脂牛奶作保护剂，冻干保存
二、酶结合物的制备方法
作为酶标记对象的抗原与抗体要求：
抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比 活性较高，能批量生产，易纯化。
制备方法要求：
（1）技术方法简单、产率高，重复性好； （2）标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性； （3）酶标记物稳定 ，不形成聚合物。
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP) ， ALP:系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的
水解酶，由多个同功酶组成。
小牛肠粘膜ALP分子量为100kDa，酶作用的最适pH为9.6；
大肠杆菌ALP分子量为80kDa，最适pH为8.0。 ALP作用底物较多，常用的酶底物有对硝基苯磷酸盐(PNP) 、β-甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。 ALP主要用作双标记染色，研究递质共存及酶免疫测定。
ALP标记抗体，一般采用戊二醛作交联剂一步法，使酶和抗
体蛋白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。
ALP常用底物
底物 pNPP 对-硝基苯磷酸酯 NBT 产物性质 黄色产物----硝基酚 不溶性黑紫色沉淀 主要吸收峰波长（nm） 405nm 免疫印迹
其它：酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、碳酸苷酶、溶菌酶和脲酶
（二）戊二醛交联法
原理：戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂，通过它的两
个醛基分别与HRP和抗体蛋白的氨基结合，形成HRP-戊二 醛-Ab蛋白结合物。 戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合，同时加入戊二醛进 行交联反应。
戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用，形成酶-戊二醛结合
物，结过透析或层析除去未结合的戊二醛，然后再与抗体结 合。
第三节 酶标记物的制备
一、酶制剂及其底物
作为标记抗体用的酶应满足下列要求： (1) 活性高 (2) 性质稳定 (3) 专一性强 (4) 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 (5) 方法敏感，重复性好，简单易行 (6) 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶 (HRP)和碱性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶， β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
糖邻位-0H可被碱性过碘酸盐氧化成醛基，再与抗 体蛋白中游离-NH2形成schiff碱；酶与抗体结合反 应后，再加入硼氢化钠(NaHB4）还原成稳定的 HRP-IgG偶联物。 所获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和IgG 结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重
大损失，是目前最常用的方法。
HRP标记多抗
1、取10mgHRP溶于0.2 mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、
pH6.8PB将25%戊二醛稀释为1.25%)，室温（20℃左右）反
应结合18h。 2、用0.15mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱洗脱， 除去游离的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2PBS，4℃透析过 夜。
用于ELISA酶标抗体的各项指标参数
评价 酶结合量(mg/ml) 酶结合率(%) 酶/IgG摩尔比 最好 ≥1.0 ＞30 ＞1.5 好 ≥0.5 9～10 1.0 一般 0.4 7 0.7
采用直接ELISA法测定酶标单抗效价，以特异显
色为1.0时的稀释倍数作为酶标单抗效价。
直接ELISA法测HRP-IgG效价
辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)
HRP比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备。
HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，由无色的酶蛋白和 棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。 HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9, 酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，PH5左右。 HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm ，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ表示酶的纯度。
（2）定量和克分子比值测定：分光光度计测定(光程1cm)
酶量(mg/ml)＝OD403nm×0.4
IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm× 0.3)×0.62(过碘酸盐)
Leabharlann Baidu
IgG量(mg/ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62(戊二醛) 酶量(mg/ml) IgG量(mg/ml) 酶量 HRP/IgG (摩尔比) ＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── ×4 40,000 160,000 IgG量 标记率 = OD403nm/OD280nm
几种常用标记方法比较
方法
直接结 过碘酸 合法 盐氧化 法 戊二醛 一步法 交 联 法
原理
酶标记率
70% 过碘酸钠氧化酶分子表面多糖羟基成醛基， 与抗体/抗原中氨基反应，形成Schiffs碱。 酶和抗体/抗原同时加入戊二醛溶液中， 戊二醛两醛基分别与酶及抗体/抗原上氨 基反应，生成Schiffs碱 1～5%
HRP常用底物
底物 ABTS OPD 邻苯二胺 TMB 四甲基联苯胺 产物性质 绿色水溶性产物 桔黄色水溶性产物 蓝色水溶性产物 加入硫酸或磷酸，产生黄色 主要吸收峰波长（nm） 410、650 492 370、652 450 免疫组化 免疫印迹、免疫组化 多重染色的第二标记
DAB 不溶性棕色沉淀 3.3－二氨基联苯胺 Chloronaphthol AEC 产物颜色介于蓝色-蓝紫色，易于成像 棕红色沉淀，容易成像