第3章--细胞生物学研究方法(翟中和第四版)
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• 免疫荧光技术
• 荧光素直接标记技术
• 绿色荧光蛋白(GFP)的 基因与编码某种蛋白质 的基因相融合表达
• 两种以上荧光素标记同 一样品，可同时显示不 同成分在细胞中的定位
（三）荧光显微镜——应用
• 在光镜水平上，
对细胞内特异的 蛋白质、核酸、 糖类、脂质以及 某些离子等组分 进行定性定位研 究的有力工具
Cell (© Garland Science 2008)
正置显微镜与倒置显微镜比较
组成一样，倒置显微镜的物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下， 后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。
（三）荧光显微镜——基本原理 • 荧光：分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到
激发态，再从激发态回到基态而发出的可见光(波 长比入射光长)
• 从细胞的发现、细胞学 说的建立，直至今天光 学显微镜仍然是细胞生 物学研究的重要工具
1. 目镜 3. 物镜
2. 准焦螺旋 4. 载物台
5. 反光镜
（一）普通复式光学显微镜——组成
• 由3 部分组成：
– 光学放大系统（目镜 与物镜） – 照明系统（光源和 聚光镜） – 镜架及调节系统
（一）普通复式光学显微镜——成像
相位差转换成振幅差，实
现对非染色活细胞的观察
– A. 当两束光的相位相同时， 相互干涉的结果使光波的振 幅增加 – B. 当两束光的相位相反时， 则导致光波的振幅降低
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
• 相差显微镜是在普通光学显微 镜的基础上，添加 “环状光阑” 和 “相差板”，将光程差或相 位差，转换成振幅差
• 样品不需固定包
埋
冰冻蚀刻电镜照片
和 冰 冻 蚀 刻 电 镜 照 片 比 较
透 射 电 镜 照 片 与 冰 冻 断 裂
电镜三维重构与低温电镜技术
• 电镜三维重构技术
• 低温电镜技术
• 电子扫描断层成像技术
核孔复合物
（三）扫描电镜技术
• 利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”激发样品表面放出 的二次电子成像，可以得到样品表面的立体形貌
息，形成清晰的二维图像
• 分辨率比普通荧光显微镜1.4～
1.7 倍
（四）激光扫描共焦显微镜
• 可通过“光学 切片” 叠加后重构出样品的三维结构
(二向的)
Figure 9-20 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
3D Image Reconstruction
荧光显微镜显示出在有丝分裂中期细胞中，纺 锤体微管（绿色）、中期染色体（蓝色）和原 纤维状蛋白（fibrillarin）（红色）等结构成分
（四）激光扫描共焦显微镜
• 以激光为光源 • 聚光镜和物镜同时聚焦到同一点 上，排除焦平面以外的成像 • 利用激光扫描装置和计算机高速
采集与处理汇聚每一个点上的信
（二）透射电镜制样技术——超薄切片技术
环氧树脂
戊二醛和 四氧化锇
黑白图像
超薄切片
重金属盐
厚度40-50nm
超薄切片技术显示的细胞超微结构
• 应用超薄切片技术，几乎可以观察细胞的各种超微结构
Figure 9-45 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
（三）扫描电镜技术
• 样品利用CO2 临界 点干燥法处理 • 样品观察前喷镀一 层金膜 • 一般扫描电镜的分 辨本领仅为3 nm
Figure 9-49 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
小结：光镜、透射电镜与扫描电镜原理比较
http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/4Intro_Fl ow/player.html
应用 1.分析细胞中DNA, RNA 含量和细胞表面分子含量 2. 细胞、细胞组分的分选
第三节 细胞培养与细胞工程
http://www.infobarrel.com/The_Origin_of_Hela_Cells
一、细胞培养——动物细胞培养
• • • • • 分为原代细胞和传代细胞 细胞系：有限细胞系和连续细胞系 细胞株： 基本形态：成纤维样细胞和上皮样细胞 贴壁培养和悬浮培养
动物细胞培养
原代细胞 1—10代以内的细胞 传代细胞 在体外培养条件下持续传代培养的细胞 接触抑制 贴壁生长细胞分裂生长到表面接触时停止分裂 生长的现象 细胞系 （Cell line) 极少数细胞在传10代后可渡过危 机而传下去40-50代次并仍保持原来的染色体的二 倍体数量及接触抑制行为 有限细胞系 永生细胞系：细胞发生了遗传改变(染色体明显改
二、细胞成分的细胞化学显示方法
• 显色剂与细胞组分中特殊基团的结合 • 通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、 核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量
福尔根反应 Feulgen stain
• 特异显示细胞内呈紫红色 的DNA 的分布
• 原理：酸水解可以去除 RNA，仅保留 DNA，并除 去DNA 上嘌呤脱氧核糖核 苷键的嘌呤，使 脱氧核糖 的醛基暴露。所暴露的自 由醛基与希夫试剂 （Schiff’s reagent）反应 呈紫红色
三、特异蛋白抗原的定位与定性
• 细胞内特异蛋白的显示可通过 抗原－抗体特异结合的方法得 以实现
• 若抗体偶联荧光染料，则可以
通过荧光显微镜、激光共焦显 微镜观察 • 为了观察特异蛋白在细胞内的 精细定位，抗体需偶联电子致 密物(胶体金)，用电镜观察
（一）免疫荧光技术
• 直接间接免疫荧光技术（A） • 间接免疫荧光技术（B）
体外培养MDCK 细胞在普通（明视场）光学显微镜（A） 和相 差显微镜（B）下拍摄图像效果的比较
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
• 微分干涉显微镜以平面偏 振光为光源，使样品中厚 度上的微小区别转化成明 暗区别
– 分辨率比普通光镜提高了一 个数量级 – 录像增差显微镜可以用来直 接观察颗粒物质沿着微管运
（二）免疫电镜技术
• 在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位 • 免疫胶体金技术受到越来越多的青睐
四、细胞内特异核酸的定位与定性
• 原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核
苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置
原位杂交技术
• 光镜水平
– 同位素标记或荧光素标记的探针
• 电镜水平
– 生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金 标记结合
• 细菌
0.1-0.3 µm
0.5-5.0 µm
• 动植物细胞 20-30 µm
• 活细胞多是无色透明的
显微镜观察范围
肉眼观察范围
分辨率
• 肉眼 0.2 mm • 光学显微镜 0.2 µm
• 电子显微镜 0.2 nm
• 扫描隧道显微镜
• 样品制备技术
一、光学显微镜 (light microscope)
第二节 细胞及其组分的分析方法
一、用超离心技术分离细胞组分
差速离心
• 差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，
将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开
一、用超离心技术分离细胞组分
• 密度梯度离心：通过离心力的作用使样品中不同组分以
不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降带
y
z
x
y
y
y
z
z x
荧光显微镜（a）和激光扫描共焦显微镜（b）
二、电子显微镜
透射电镜
transmission
electron microscope, TEM
扫描电镜
scanning electron
microscope, SEM
（一）透射电子显微镜
• 电子束作为光源 • 电磁透镜聚焦 • 镜筒高度真空 • 图像通过荧光屏或感光胶
片记录
1．电子显微镜与光学显微镜的基本区别
Figure 9-42 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
光镜
光源
分辨率 透镜 真空
电镜
可见光（300-700nm）电子束 紫外光（200nm） 200nm 0.2nm 玻璃透镜 磁透镜 无要求 1.33*10-3—10-5Pa
（三）荧光显微镜——基本原理
• 光源和光学系统与普通光学显微镜不同
• 核心部件是滤光片系统及专用物镜镜头
• 滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成
1.照明方式通常为落射式 2.光源为紫外光或其他短波 长的光 3.有两个特殊的滤光片 (发射滤片和阻断滤片)
荧 光 显 微 镜 光 路 系 统
（三）荧光显微镜——样品制备
• 放大的倒立虚像
– 经物镜形成倒立实像
– 经目镜进一步放大成
虚像
（一）普通复式光学显微镜——分辨率 • 分辨率：显微镜最重要的性能参数
• 分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离 • 普通光学显微镜最大分辨率0.2 µm
λ: 光源波长 N : 介质折射率, 空气为1, 油为1.4 α: 物镜镜口角(最大140o, Sinα/2 最大0.94 )
镜口角是指被观察点射入物镜 前透镜的边缘光线之间的夹角。
（一）普通复式光学显微镜——样品制备
石蜡切片
H.E染色
Figure 9-10, 11a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
• 利用光线干涉的原理，将
注意样品
制备技术
的差异！
三、扫描隧道显微镜
• 探测微观世界物质 表面形貌 • 利用量子力学中的 隧道效应
• 具有原子尺度的高 分辨本领
• 可以在真空、大 气、液体等多种条 件下工作
• 非破坏性测量
http://en.wikipedia.org/wiki/File:ScanningTunnelingMicroscope_schematic.png
FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)
五、定量细胞化学分析与细胞分选技术
• 流式细胞术
流式细胞术是对细胞进行快速定量分析与分选 的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的 细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞 的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光 和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算 机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出 高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。（flow cytometer）。
输的动态过程
Figure 9-9 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Four types of light microscopy
(A) The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, a technique known as bright-field microscopy (B) phase-contrast microscopy (C) Nomarski differential-interference-contrast microscopy (D) dark-field microscopy Figure 9-8 Molecular Biology of the
翟中和 王喜忠 丁明孝 主编
细胞生物学（第4版）
第3章 细胞生物学研究源自文库法
本章主要内容
• 细胞形态结构的观察方法 • 细胞及其组分的分析方法 • 细胞培养与细胞工程
• 细胞及其生物大分子的动态变化
• 模式生物与功能基因组的研究
第一节 细胞形态结构的观察方法
直径 • 病毒 20-200 nm
• 支原体
电子束的波长与加速电压有关。当加速电压为50～100千 伏时，电子束波长约为0.0053～0.0037纳米
2．电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数
• 电子显微镜分辨率可达 0.2 nm • 电镜的分辨本领是指电 镜处于最佳状态下的分 辨率
3．电子显微镜的基本构造
• 电子束照明系统 • 成像系统 • 真空系统 • 记录系统
（二）透射电镜制样技术——负染色技术
• 观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至 病毒等 • 重金属盐沉积在铜网上，而样品未被染色（故名负染） • 分辨率可达1.5 nm 左右
（二）透射电镜制样技术——冷冻蚀刻技术
• 包括冰冻断裂与
蚀刻复型两步
• 观察膜断裂面上 的蛋白质颗粒和 膜表面形貌特征， 图像有立体感
• 荧光素直接标记技术
• 绿色荧光蛋白(GFP)的 基因与编码某种蛋白质 的基因相融合表达
• 两种以上荧光素标记同 一样品，可同时显示不 同成分在细胞中的定位
（三）荧光显微镜——应用
• 在光镜水平上，
对细胞内特异的 蛋白质、核酸、 糖类、脂质以及 某些离子等组分 进行定性定位研 究的有力工具
Cell (© Garland Science 2008)
正置显微镜与倒置显微镜比较
组成一样，倒置显微镜的物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下， 后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。
（三）荧光显微镜——基本原理 • 荧光：分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到
激发态，再从激发态回到基态而发出的可见光(波 长比入射光长)
• 从细胞的发现、细胞学 说的建立，直至今天光 学显微镜仍然是细胞生 物学研究的重要工具
1. 目镜 3. 物镜
2. 准焦螺旋 4. 载物台
5. 反光镜
（一）普通复式光学显微镜——组成
• 由3 部分组成：
– 光学放大系统（目镜 与物镜） – 照明系统（光源和 聚光镜） – 镜架及调节系统
（一）普通复式光学显微镜——成像
相位差转换成振幅差，实
现对非染色活细胞的观察
– A. 当两束光的相位相同时， 相互干涉的结果使光波的振 幅增加 – B. 当两束光的相位相反时， 则导致光波的振幅降低
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
• 相差显微镜是在普通光学显微 镜的基础上，添加 “环状光阑” 和 “相差板”，将光程差或相 位差，转换成振幅差
• 样品不需固定包
埋
冰冻蚀刻电镜照片
和 冰 冻 蚀 刻 电 镜 照 片 比 较
透 射 电 镜 照 片 与 冰 冻 断 裂
电镜三维重构与低温电镜技术
• 电镜三维重构技术
• 低温电镜技术
• 电子扫描断层成像技术
核孔复合物
（三）扫描电镜技术
• 利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”激发样品表面放出 的二次电子成像，可以得到样品表面的立体形貌
息，形成清晰的二维图像
• 分辨率比普通荧光显微镜1.4～
1.7 倍
（四）激光扫描共焦显微镜
• 可通过“光学 切片” 叠加后重构出样品的三维结构
(二向的)
Figure 9-20 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
3D Image Reconstruction
荧光显微镜显示出在有丝分裂中期细胞中，纺 锤体微管（绿色）、中期染色体（蓝色）和原 纤维状蛋白（fibrillarin）（红色）等结构成分
（四）激光扫描共焦显微镜
• 以激光为光源 • 聚光镜和物镜同时聚焦到同一点 上，排除焦平面以外的成像 • 利用激光扫描装置和计算机高速
采集与处理汇聚每一个点上的信
（二）透射电镜制样技术——超薄切片技术
环氧树脂
戊二醛和 四氧化锇
黑白图像
超薄切片
重金属盐
厚度40-50nm
超薄切片技术显示的细胞超微结构
• 应用超薄切片技术，几乎可以观察细胞的各种超微结构
Figure 9-45 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
（三）扫描电镜技术
• 样品利用CO2 临界 点干燥法处理 • 样品观察前喷镀一 层金膜 • 一般扫描电镜的分 辨本领仅为3 nm
Figure 9-49 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
小结：光镜、透射电镜与扫描电镜原理比较
http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/4Intro_Fl ow/player.html
应用 1.分析细胞中DNA, RNA 含量和细胞表面分子含量 2. 细胞、细胞组分的分选
第三节 细胞培养与细胞工程
http://www.infobarrel.com/The_Origin_of_Hela_Cells
一、细胞培养——动物细胞培养
• • • • • 分为原代细胞和传代细胞 细胞系：有限细胞系和连续细胞系 细胞株： 基本形态：成纤维样细胞和上皮样细胞 贴壁培养和悬浮培养
动物细胞培养
原代细胞 1—10代以内的细胞 传代细胞 在体外培养条件下持续传代培养的细胞 接触抑制 贴壁生长细胞分裂生长到表面接触时停止分裂 生长的现象 细胞系 （Cell line) 极少数细胞在传10代后可渡过危 机而传下去40-50代次并仍保持原来的染色体的二 倍体数量及接触抑制行为 有限细胞系 永生细胞系：细胞发生了遗传改变(染色体明显改
二、细胞成分的细胞化学显示方法
• 显色剂与细胞组分中特殊基团的结合 • 通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、 核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量
福尔根反应 Feulgen stain
• 特异显示细胞内呈紫红色 的DNA 的分布
• 原理：酸水解可以去除 RNA，仅保留 DNA，并除 去DNA 上嘌呤脱氧核糖核 苷键的嘌呤，使 脱氧核糖 的醛基暴露。所暴露的自 由醛基与希夫试剂 （Schiff’s reagent）反应 呈紫红色
三、特异蛋白抗原的定位与定性
• 细胞内特异蛋白的显示可通过 抗原－抗体特异结合的方法得 以实现
• 若抗体偶联荧光染料，则可以
通过荧光显微镜、激光共焦显 微镜观察 • 为了观察特异蛋白在细胞内的 精细定位，抗体需偶联电子致 密物(胶体金)，用电镜观察
（一）免疫荧光技术
• 直接间接免疫荧光技术（A） • 间接免疫荧光技术（B）
体外培养MDCK 细胞在普通（明视场）光学显微镜（A） 和相 差显微镜（B）下拍摄图像效果的比较
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
• 微分干涉显微镜以平面偏 振光为光源，使样品中厚 度上的微小区别转化成明 暗区别
– 分辨率比普通光镜提高了一 个数量级 – 录像增差显微镜可以用来直 接观察颗粒物质沿着微管运
（二）免疫电镜技术
• 在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位 • 免疫胶体金技术受到越来越多的青睐
四、细胞内特异核酸的定位与定性
• 原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核
苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置
原位杂交技术
• 光镜水平
– 同位素标记或荧光素标记的探针
• 电镜水平
– 生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金 标记结合
• 细菌
0.1-0.3 µm
0.5-5.0 µm
• 动植物细胞 20-30 µm
• 活细胞多是无色透明的
显微镜观察范围
肉眼观察范围
分辨率
• 肉眼 0.2 mm • 光学显微镜 0.2 µm
• 电子显微镜 0.2 nm
• 扫描隧道显微镜
• 样品制备技术
一、光学显微镜 (light microscope)
第二节 细胞及其组分的分析方法
一、用超离心技术分离细胞组分
差速离心
• 差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，
将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开
一、用超离心技术分离细胞组分
• 密度梯度离心：通过离心力的作用使样品中不同组分以
不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降带
y
z
x
y
y
y
z
z x
荧光显微镜（a）和激光扫描共焦显微镜（b）
二、电子显微镜
透射电镜
transmission
electron microscope, TEM
扫描电镜
scanning electron
microscope, SEM
（一）透射电子显微镜
• 电子束作为光源 • 电磁透镜聚焦 • 镜筒高度真空 • 图像通过荧光屏或感光胶
片记录
1．电子显微镜与光学显微镜的基本区别
Figure 9-42 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
光镜
光源
分辨率 透镜 真空
电镜
可见光（300-700nm）电子束 紫外光（200nm） 200nm 0.2nm 玻璃透镜 磁透镜 无要求 1.33*10-3—10-5Pa
（三）荧光显微镜——基本原理
• 光源和光学系统与普通光学显微镜不同
• 核心部件是滤光片系统及专用物镜镜头
• 滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成
1.照明方式通常为落射式 2.光源为紫外光或其他短波 长的光 3.有两个特殊的滤光片 (发射滤片和阻断滤片)
荧 光 显 微 镜 光 路 系 统
（三）荧光显微镜——样品制备
• 放大的倒立虚像
– 经物镜形成倒立实像
– 经目镜进一步放大成
虚像
（一）普通复式光学显微镜——分辨率 • 分辨率：显微镜最重要的性能参数
• 分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离 • 普通光学显微镜最大分辨率0.2 µm
λ: 光源波长 N : 介质折射率, 空气为1, 油为1.4 α: 物镜镜口角(最大140o, Sinα/2 最大0.94 )
镜口角是指被观察点射入物镜 前透镜的边缘光线之间的夹角。
（一）普通复式光学显微镜——样品制备
石蜡切片
H.E染色
Figure 9-10, 11a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
• 利用光线干涉的原理，将
注意样品
制备技术
的差异！
三、扫描隧道显微镜
• 探测微观世界物质 表面形貌 • 利用量子力学中的 隧道效应
• 具有原子尺度的高 分辨本领
• 可以在真空、大 气、液体等多种条 件下工作
• 非破坏性测量
http://en.wikipedia.org/wiki/File:ScanningTunnelingMicroscope_schematic.png
FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)
五、定量细胞化学分析与细胞分选技术
• 流式细胞术
流式细胞术是对细胞进行快速定量分析与分选 的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的 细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞 的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光 和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算 机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出 高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。（flow cytometer）。
输的动态过程
Figure 9-9 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Four types of light microscopy
(A) The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, a technique known as bright-field microscopy (B) phase-contrast microscopy (C) Nomarski differential-interference-contrast microscopy (D) dark-field microscopy Figure 9-8 Molecular Biology of the
翟中和 王喜忠 丁明孝 主编
细胞生物学（第4版）
第3章 细胞生物学研究源自文库法
本章主要内容
• 细胞形态结构的观察方法 • 细胞及其组分的分析方法 • 细胞培养与细胞工程
• 细胞及其生物大分子的动态变化
• 模式生物与功能基因组的研究
第一节 细胞形态结构的观察方法
直径 • 病毒 20-200 nm
• 支原体
电子束的波长与加速电压有关。当加速电压为50～100千 伏时，电子束波长约为0.0053～0.0037纳米
2．电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数
• 电子显微镜分辨率可达 0.2 nm • 电镜的分辨本领是指电 镜处于最佳状态下的分 辨率
3．电子显微镜的基本构造
• 电子束照明系统 • 成像系统 • 真空系统 • 记录系统
（二）透射电镜制样技术——负染色技术
• 观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至 病毒等 • 重金属盐沉积在铜网上，而样品未被染色（故名负染） • 分辨率可达1.5 nm 左右
（二）透射电镜制样技术——冷冻蚀刻技术
• 包括冰冻断裂与
蚀刻复型两步
• 观察膜断裂面上 的蛋白质颗粒和 膜表面形貌特征， 图像有立体感