茶多糖的提取纯化研究
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茶多糖的提取纯化研究
姜波，齐桂年，尹旭敏，王雪萍
（四川农业大学茶学系，四川雅安 625014）
摘要：茶多糖在成品茶中含量为1％左右，尤其是粗老茶中含量较高。现今，多糖的分离纯化有了很大进展，但是如何提高茶多糖分离纯化的效率却一直是个亟待解决的问题，而且茶多糖的含量与组成会随着提取方法和工艺的不同而有很大的差异。
关键词：茶多糖，提取，纯化
1. 引言
活性多糖专指具有某种特殊生物活性的多糖化合物，包含植物多糖、真菌多糖等。植物活性多糖中较为重要的一种是茶多糖，茶多糖广泛存在于茶叶中，尤其是粗老茶中含量较高[6]。
茶多糖(Tea polysaccharide，简称TPS)，在成品茶中含量为1％左右[7]，它是一类与蛋白质结合在一起的酸性多糖或一种酸性糖蛋白，具有许多特殊的生理功能[2]。近20年来，多糖的分离纯化、组成测定和结构分析都有了很大进展，但是如何提高茶多糖分离纯化的效率却一直是个亟待解决的问题，而且茶多糖的含量与组成[11]会随着提取方法和工艺的不同而有很大的差异。清水岑夫等[1]从茶叶冷水提取物中分离的茶多糖，分子量为40 000，由阿拉伯糖、核糖和葡萄糖以5．1：4．7：1．7比例组成；王丁刚等[9]提取的茶多糖分子量为91 000，由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖以0．23：1．04：0．62：2．43：1．00比例组成；汪东风等[3]用紫外、红外、气相色谱法分离的茶多糖分子量为107 000，由阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖以5．52：2．21：6．08：44．2：41．99比例组成。但至今茶多糖中单糖存在键型及其连接方式尚未明了[5]。2. 茶多糖的提取技术
2.1 茶多糖的提取方法
根据提取原料茶多糖含量、提取仪器试剂、提取步骤及提取过程的差异，TPS提取方法主要有以下几种：
https://www.360docs.net/doc/bc18099477.html, 2.1.1 单一提取法[34]
﹙1﹚乙醇沉淀法
温水浸提浓缩乙醇沉淀
原料粉碎水提液浓缩液沉淀物
水溶乙醇沉淀
水溶液沉淀物冷冻干燥TPS提取物
﹙2﹚乙醇提取法
乙醇浸泡回流(2~3次) 过滤原料粉碎取滤渣沸水提取(3次) 提取液
浓缩、脱脂、脱蛋白、脱色等乙醇沉淀(2次) 取滤渣干燥精制TPS ﹙3﹚超滤法[33]
温水浸提超滤乙醇沉淀
原料粉碎水提液截流液沉淀物
冷冻干燥TPS提取物
﹙4﹚CTBA沉淀法[19]
温水浸提浓缩5%CTBA沉淀
原料粉碎水提液浓缩液沉淀物
20%NaCl溶解乙醇沉淀
水溶液沉淀物冷冻干燥TPS提取物
﹙5﹚纤维素酶法[31]
温水浸提过滤
原料粉碎水提液
滤液()
Ⅰ
柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(pH=4.6) 水浴(50)
℃
滤渣酶液灭酶液滤液()
Ⅱ
适量酶调pH=7
分别离心、真空浓缩乙醇沉淀
浓缩液沉淀物精制干燥
TPS(水提)
TPS提取物
TPS(酶提)
2.1.2 综合提取法[9，17]
该法具有简化、省试剂、效益高等优点。可分两类：
﹙1﹚沸水浸提
粉碎CCl3萃取
原料沸水浸提(2次) 离心、除渣提取液
有机层CCl3回收、干燥精制咖啡碱
有机层回收、干燥精制茶多酚
乙酸乙酯萃取
水层乙醇醇析
水层滤渣精制干燥茶多糖
离心
﹙2﹚乙醇浸提
粉碎
原料乙醇浸提
酸性乙醇提取丙酮分离
滤渣滤液回收、精制干燥茶多糖
有机层回收、精制干燥咖啡碱
有机层回收、精制干燥茶多酚
水层浓缩干燥水溶性复合物
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https://www.360docs.net/doc/bc18099477.html, 2.2 影响茶多糖提取率的因素
浸提试剂不同，提取的成分就不尽相同，则茶叶复合多糖的取得率也就不同。中国农科院茶叶研究所的研究表明[32]，总糖含量：
酸性乙醇提取法(47．7％) ＞水浸提法(43．1％) ＞热酚法(32．8％)
由于前两种方法的提取量仅相差4．6％，从生产成本和安全性的角度考虑，水浸提法为最适方法[14]。因此，对以下各因素总结都是以水浸提为前提条件。2.2.1 原料
茶叶的产地、品种、成品茶种类、茶叶老嫩以及树龄不同，茶多糖的含量也就不同，所以原料的选择对茶多糖的提取率影响[17]很大。
2.2.1.1 产地品种
严俊等[4]用蒽酮—硫酸法测定了茶叶中的可溶性总糖(包括单糖、双糖、多糖、淀粉等)。对于绿茶，河南信阳毛尖3．07％，江苏碧螺春3．01％，浙江西湖龙井2．77％，这在一定程度上说明了多糖的含量也与茶叶的产地、品种有关。
2.2.1.2 成品茶种类
对同一产地的茶叶，绿茶初制仅高温杀青，多糖向单糖转化的程度低。而乌龙茶则两晒两晾有利于多糖的水解。红茶为全发酵茶，多糖水解程度很大，多糖含量最低。汪东风等[20]研究表明对同一品种的红茶和绿茶，均为六级茶，茶多糖的含量，红茶为(0．85±0．10)％，绿茶为(1．41±0．06)％，绿茶比红茶高约40％。
2.2.1.3 茶叶的老嫩度
汪东风等[12]分析了不同等级茶叶中各药理成分的含量，研究表明，不论是红茶还是绿茶，等级越低，原料越粗老，茶多糖的含量越高。六级茶是一级茶的2倍左右，所以提取茶多糖要用粗老茶叶。
2.2.2 浸提条件
2.2.2.1 浸提温度
茶多糖在热水中溶解性较好，热水浸提得率高于冷水浸提。但蓑和田的专利记载，用85℃以上热水浸提，会破坏降血糖有效成分[15]，汪东风等[21]研究证实，茶多糖热稳定性较差，60℃以上降解加快。李布青[13]研究表明，茶多糖可能为一酸性糖蛋白，为防止其变性失活，他采用冷水反复浸泡浸提。倪德江等[32]的结论是随浸提温度升高，TPS提取率明显增加，且温度对TPS活性有一定影响，但并不明显，只是温度超过72．5 ℃时活性有所降低。
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2.2.2.2 pH值
TPS的提取应避免在强酸强碱中进行，否则易使茶多糖中糖苷键断裂及构象变化，从而降低或失去生物活性。研究表明[23]浸提液的酸碱度对茶多糖的得率影响最大，突出表现在浸提液偏碱时TPS得率明显增加，这与TPS是一种酸性杂多糖，在碱性溶液中更易浸出有关。但在酸性或碱性条件下所浸提的茶多糖生物活性有所降低，糖链和肽链都有不同程度的破坏，故其提取可在稀酸、稀碱或稀盐中进行。若用稀酸提取，时间宜短，温度≤5℃；若用稀碱提取，应在N2中进行，以防多糖降解。
2.2.2.3 沉淀剂
茶叶浸出液中含有丰富的其它成分，选用的沉淀剂及其用量不同，不仅茶多糖的得率不同，而且组成成分也不同。李布青等[13]证实茶多糖为酸性多糖，利用溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)可与酸性多糖阴离子形成不溶性络合物，他们将提取液先用CTAB二次沉淀，20％NaCl溶解后离心，上清液再加2倍体积的丙酮沉淀，所得茶多糖中总糖含量51．2％，降血糖效果最佳；而仅用3倍体积95％乙醇沉淀所得茶多糖中总糖含量为21．1％，血糖降低值偏低[22]。但从安全和经济角度考虑，使用乙醇使含醇量达70％比较合适。
2.2.2.4 浸提时间与次数
一般浸出量与浸提时间呈正比[26]。但达到扩散平衡后，时间因素就不在起作用。达平衡时间与水的体积、温度有关。而增加浸提次数，即增加浓度差能大大提高浸出率，但一般2～3次即可。
2.2.2.5 料液比
溶媒不同，则提取成分不同，茶叶复合多糖的得率也就不同。溶媒的体积越大，提取越彻底，但会增加浓缩的工作量、试剂用量和成本。一般固液比为1：20—1：30最为适宜[27]。
2.2.3 其他因素
2.2.
3.1 原料处理
①粉碎处理茶叶粉碎后与溶媒的接触面增大，浸出率提高。一般植物粉碎机将茶叶粉碎至40—50目，太细会使过滤困难[10]。目前已有一些现代新技术用于组织破碎。印度班加罗尔Bedi&Bedi公司研究发现，用超声波处理茶叶可使组织破碎率达到98％。
②脱脂处理茶叶细胞外有脂质包围，最好除去表面脂肪以提高水浸出率。可使用的脱脂溶剂为甲醇、乙醇、乙醇乙醚混合液(1：1)，水溶加热搅拌1 h或回流提取1—3 h。
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2.2.
3.2 微波处理
微波技术应用于TPS提取具有短时、高效、节能等优点。微波联合水浴提取，在提高TPS得率，降低成本的同时还可减少污染；微波联合水浴提取法可有效弥补乙醇提取成本高，沸水提取时间长，有效成分破坏大的不足[18]。
2.2.
3.3 纤维素酶处理
纤维素酶常被用于改善细胞壁的通透性以提高细胞内含物的取得率。采用纤维素酶提取茶多糖可以在较低的温度下提高多糖的提取率。谭淑宜等[8]发现，在茶汤中添加0．3％的纤维素酶可使水浸出率提高20％左右。
3. 茶多糖的纯化[29]
3.1 茶多糖的初步纯化
3.1.1 除去蛋白质
因为制备饮料时若残存有蛋白质，不仅会使饮料因美拉德反应(Maillard reaction)而使饮料色变，而且往往有沉淀物产生，故需除去蛋白质。实际操作中，可采用以下几种方法：
Sevag
①法它是根据蛋白质在CCl3等有机溶剂中变性的特点，使蛋白质变性呈胶状后离心除去。此法条件温和，可避免多糖的降解。缺点是一次只能除去少量蛋白质，一般4—5次方能除尽；多糖常因多次除蛋白而损失。
②三氟三氯乙烷法此方法虽然效率较高，但因其易挥发，不宜大量应用。
③三氯乙酸法此方法除蛋白效果较好，但较为剧烈，往往会引起某些多糖的降解，使得率降低；据张翼伸等[16]报道，用酸水解方法适当降解，并不影响其生理活性，故三氯乙酸法蛋白质脱除效果更好。另外，李布青等证实茶多糖是一类与蛋白质结合在一起的酸性多糖或一种酸性糖蛋白，故不能使用蛋白酶去除蛋白质，而且茶多糖中的游离蛋白质的碱性氨基酸会与多糖链上的酸性基团产生静电结合，使脱除游离蛋白产生困难。
3.1.2 脱色
茶叶富含茶多酚，而茶多酚极易氧化变色，干燥后颜色更深，从而影响了茶多糖在饮料中的应用，故需脱色。茶叶复合多糖脱色主要是用H2O2氧化。也可用弱碱性树脂LEAE纤维素吸附其它色素。虽然活性炭也有脱色的作用，但脱色过程中活性炭会还吸附多糖，故一般不用。
经除去蛋白质，脱色处理后的多糖溶液，用半透膜透析法除去小分子物质后，再经浓缩、醇沉淀、精制，最后真空干燥所得多糖就可用于饮料生产了。
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3.2茶多糖的进一步纯化
若要进一步分析茶叶复合多糖的组成、相对分子量、化学结构和药理，还须进一步分离纯化。
3.2.1 分步沉淀法
不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度，按比例由小到大加入这些醇或酮分部沉淀。黄桂宽等用40％和60％的乙醇分级沉淀，干燥后得到浅黄色与灰白色的茶叶多糖TP—1和TP—2，得率分别为2．8％和0．7％，总糖含量分别为48．24％和57．71％。而TP—1为中性杂多糖。此方法适宜于分离各种溶解度相差较大的多糖。
3.2.2 纤维素阴离子交换剂柱层析
常用的交换剂为DEAE—纤维素。此方法适合于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。吸附力随多糖分子中酸性基团的增加而增加。李布青等将脱蛋白后的茶多糖用DEAE—纤维素柱层析，再用0．1 mol/L的NaOH洗脱，获得了较纯的茶。
3.2.3 季胺盐沉淀法
长链季胺盐能与酸性多糖成盐形成水不溶性化合物，可分离酸性及中性多糖。常用的季胺盐是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)及其碱(CTA—OH)和十六烷基吡啶(CPC)。实验时必须严格控制多糖混合物的pH值＜8及无硼砂存在，否则中性多糖也会沉淀出来。
3.2.4 超滤法
不同的超滤膜具有允许不同分子量和形状的物质通过的性质。茶叶复合多糖粗品中真正有较强生理活性部分的相对分子质量约在4×104—10×104之间，膜孔径可选用相对分子量10×104以上不通过和相对分子量4×104以下不通过的膜系统。操作时，压力不能过大。温度最好45—50℃以下，这样茶多糖既不会变性，又能降低粘度增加膜通量。
3.2.5 凝胶柱层析[28]
该法是根据多糖分子的大小和形状不同进行分离。常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)及琼脂糖凝胶(Sepharose)。茶多糖分离时多选用Sephadex G—50以分离相对分子量在1万以下的各组分，然后选用Sephadex G—150—200进一步纯化。展层剂为各种浓度的盐溶液及缓冲液，一般用0．1mol／L NaCl。王丁刚等将20mg茶叶多糖粗品用少量0．1 mol／L NaCl溶液溶解，经Sephadex G—100柱层析(20×430mm)，用0．1mol／L NaCl溶液洗脱，苯酚—硫酸法进行检测，
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收集糖反应阳性高峰部分，醇沉，干燥，即得纯化的茶叶多糖。
要注意的是，对茶叶复合多糖的纯化，其纯度是相对的，不可能象某些成分那么单纯。这里的纯化仅是得到相对分子量在某一范围里较为均一的多糖。4. 茶多糖纯度的测定方法[25]
茶多糖的纯度标准不能用通常化合物的纯度标准来衡量，因为茶多糖纯品其微观上也是不均一的，其纯度只代表相似链长的平均配布，纯品也仅是一定分子质量范围的均一组分。常用于活性多糖纯度鉴定的方法有水解法、超离心法、凝胶层析法、高压电泳法、旋光测定法等。
茶多糖的纯度可用以下物理与化学的方法检测：
①用水解法在重复纯化过程中单糖组成及其比例不变，理化性质也不变，则表明是均一组分。
②超离心是将活性多糖溶液进行密度梯度离心，待转速达到6000r/min以上后，间隔照相，如得到的结果是单一峰，则证明该茶叶活性多糖是均一组分。
③茶叶活性多糖纯度鉴定中应用最多的是凝胶层析法。原因是该方法准确度高。茶多糖经凝胶层析得一对称峰，也证明茶多糖为均一组分。
④高压电泳法是利用不同的活性多糖与硼砂形成不同的复合物，这些复合物具有不同的电荷，所以在电场作用下其迁移率不同，电泳结果显色后，如呈单一色斑，则表示该茶叶活性多糖为均一组分。
⑤旋光鉴定法利用不同分子质量的活性多糖在不同浓度低级醇中溶解度差别进行的，如果在不同浓度低级醇中得到的活性多糖的比旋光度相同，则证明该茶叶活性多糖为均一组分。
目前，多采用高效液相层析或凝胶层析来检测茶多糖的分离纯化度。
我们知道，茶多糖是茶叶中的重要生理活性成分，且茶叶愈粗老其茶叶复合多糖含量越高，而现今粗老茶却随着人民生活水平的不断提高而渐渐无人问津，产品也将会大量积压，造成自然资源的浪费。
因此，用粗老茶提取茶叶复合多糖再加以开发利用，这对促进茶叶产业的发展将起到重要的推动作用，并且有重要和深远的意义。
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Study on Extraction and Purification of Tea Polysaccharide
JiangBo, QiGuinian, YinXumin
(Department of Tea Science, SiChuan Agricultural University, Yaan 625014)
Abstract
There is about 1 percent tea polysaccharide in tea of finished product, especially in coarse tea. Now, extraction and purification of polysaccharide has more developed, but it’s still a problem to how to improve efficiency of extraction and purification of tea polysaccharide, and the content and composition of tea polysaccharide is different by the different method of extraction and purification.
Key Words: Tea Polysaccharide, Extraction, Purification
茶多糖的纯化及结构分析
茶多糖的纯化及结构分析 周裔彬1,2 汪东风2 宛晓春1 杜先锋1 (1安徽农业大学食品科学与工程系茶叶生物化学重点实验室 合肥 230036; 2中国海洋大学食品学与工程学院 青岛 266003) 摘 要 从茶多酚生产的下脚料中,通过有机溶剂洗涤和凝胶色谱分离,得到一种水溶性多糖。经高效液相色谱分析,为单一茶多糖,其相对分子量为(10～1015)×105;气相色谱分析表明,糖基由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和鼠李糖组成,其摩尔比为6197∶5134∶8111∶2176∶1114;比色法测其总糖含量、蛋白含量、糖醛酸含量分别为90%、8152%、27165%。红外光谱和核磁共振分析表明,该多糖是由单糖通过β2糖苷键连接的,多糖链上络有糖醛酸、氨基或蛋白基团,同时含有α和β异头碳;x2衍射分析显示,随多糖纯度的提高,茶多糖更易结晶,且有不同的晶体聚合物出现;DSC的分析表明,随茶多糖纯度的提高,热焓增加,峰温向高温漂移。 关键词 茶多糖复合物 纯化 结构分析 Puri fication and Structural Analysis of T ea Polysaccharide Zhou Y ibin1,2,Wang D ong feng1,Wang X iaochun1,Du X ianfeng1 (1K ey Laboratory of T ea Biochemistry,Department of F ood Science and Engineering, Anhui Agricultural University,Hefei230036; 2Institue of F ood Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao26603) Abstract A water s oluble tea polysaccharide was obtained by washing with organic s olvents and is olating with gel chromatographic separation from the byproduct of tea polyphenols.A single peak of tea polysaccharide(TPS)with the relative m olecular weight(10～1015)×105was identified by HP LC.The results of G C indicated that TPS consists of glucose,galactose,arabinose,mannose and rhanose with a m olar ratio of6197∶5134∶8111∶2174∶1114;the content of total saccharide,protein and acid polysaccharide were90%,8152%and27165%,respectively.The result of IR and13C NMR showed that TPS was com posed of m onosaccharide linked byβ2glycosidic bond,there were uronic acids,amido or proteinic groups andαandβis omer in the polysaccharide chain.The analysis of x2diffraction indicated that TPS easily crystallized and formed the different crystallization as raising the purification of TPS.The analysis of DSC showed that the enthalpy and the peak tem perature of TPS increased with the purification. K eyw ords T ea polysaccharide,Purification,S tructural analysis 茶多糖主要存在于粗茶叶或茶多酚生产的下脚料中,是一种复合多糖[1,2]。目前,茶多糖的提取、纯化、组成、结构分析及生理活性等方面的研究报道所利用的茶多糖原料均来自各种茶叶[3,4]。本文以茶多酚生产中的下脚料为原料,通过纯化,对其纯度、分子量、组成、结构及结晶性、热力学等性质进行分析,以期为茶多酚下脚料的开发利用以及对茶多糖的深入研究和应用提供参考。 1 实验部分 111 材料和主要仪器 茶多糖自海南群力茶叶生化公司购得。 标准单糖、标准葡聚糖21(Dextran21,MW:190,000～230,000)、Dextran22(MW:66,700)、Dextran23 国家自然科学基金项目(20776002)资助 2007206217收稿,2008201221接受
多糖的提取和纯化
多糖的提取和纯化→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2 －3次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）。然后浓缩，再加入2－5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥（若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时，可直接冷冻干燥）。干燥后可得粉末状的粗多糖。1.2 微波辅助提取法：其原理为利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度，使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物质从基体或体系中分离出来，进入到介电常数小，微波吸收能力较差的萃取剂中[14]。由于微波能极大加速细胞壁的破裂，因而应用于中草药中有效成分的提取能极大加快提取速度，增加提取产率。而且由于其选择性好，提取后基体能保持良好的性状，提取液也较一般的提取方法澄清[15]。聂金源等在柴胡多
糖和黄酮化合物的提取[18]中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较，发现微波辅助提取法所需时间最短（10min），多糖的提取率最高（28.46％）。1.3 超声辅助法：其原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取[16]。超声波辅助法与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点[17]。1.4 索氏提取法：将植物粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，60℃-90℃条件下提取至无色（一般为6小时）。过滤，滤渣挥发干燥完溶媒后加入80%乙醇，再提取6小时，过滤，滤渣乙醇挥发干燥后加蒸馏水。回流提取2次，趁热过滤，滤液减压浓缩，再除蛋白，醇沉，除色素。60℃干燥，称重。1.5 醇提法：先后将90%和50%乙醇加入植物粉末中，振荡充分再抽滤。滤液中加入足量无水乙醇，至于4℃冰箱中过夜。减压抽滤，再除去色素，得多糖粗品，在60℃℃℃
多糖的提取分离方法
1.多糖的提取方法 生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3 大类。多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理。动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，释放多糖。植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前，应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理，目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。1．1溶剂法 1．1．1水提醇沉法 水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。多糖是极性大分子化合物，提取时应选择 水、醇等极性强的溶剂。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置 5 h，多糖的质量分数和得率均较高。影响多糖提取率的因素有：水的用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。 水提醇沉法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高。 1．1．2酸提法 为了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH 值下难以溶解，可用乙酸或盐酸使提取液成酸性，再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。 由于H＋的存在抑制了酸性杂质的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高，但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，且酸会对容器造成腐蚀，除弱酸外，一般不宜采用。因此酸提法也存在一定的不足之处。 1．1．3碱提法 多糖在碱性溶液中稳定，碱有利于酸性多糖的浸出，可提高多糖的收率，缩短提取时间，但提取液中含有其它杂质，使粘度过大，过滤困难，且浸提液有较浓的碱味，溶液颜色呈黄色，这样会影响成品的风味和色泽。 1．1．4超临界流体萃取法 超临界流体萃取技术是近年来发展起来的一种新的提取分离技术。超临界流 体是指物质处于临界温度和临界压力以上时的状态，这种流体兼有液体和气体的特点，密度大，粘稠度小，有极高的溶解，渗透到提取材料的基质中，发挥非常有效的萃取功能。而且这种溶解能力随着压力的升高而增大，提取结束后，再通过减压将其释放出来，具有保持有效成分的活性和无溶剂残留等优点。由于CO2的超临界条件（TC＝304．6 ℃，Tp＝7．38 MPa）容易达到，常用于超临界萃取的溶剂，在压力为8～40 MPa 时的超临界CO2足以溶解任何非极性、中极性化合物，在加入改性剂后则可溶解极性化物。 该法的缺点是设备复杂，运行成本高，提取范围有限。 1．2酶解法 1．2．1单一酶解法 单一酶解法指的是使用一种酶来提取多糖，从而提高提取率的生物技术。其中经常使 用的酶有蛋白酶、纤维素酶等。蛋白酶对植物细胞中游离的蛋白质具有分解作用，使其结构变得松散；蛋白酶还会使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解，降低它们对原料的结合力，有利于多糖的浸出。
多糖提取与纯化技术应用进展
作者简介：朱晓霞（１９８２－），女（汉），硕士研究生，从事天然生物大分子研究。 糖类物质是地球上数量最多的一类有机化合物，是生命物质的组成成分之一。糖类物质广泛地存在于生物界，特别是植物界。糖类物质按干重计占植物的８３％～９０％，占细菌的１０％～３０％，动物的小于２％。大量药理及临床研究证实：多糖有调节免疫、抗癌、抗肥胖、控制血糖、降胆固醇、降血脂等生理功能，可广泛应用于医药、保健品及功能食品，作为绿色生物医药产品具有广阔的市场前景。 目前多糖产品开发相当热门，也卓有成效。多糖的生理功能与其纯度和化学结构有着重要的关系，多糖的提取纯化是其研究的基础。因此科学高效地从动植物及微生物中提取、纯化其中的多糖成分是目前的核心问题。本文对多糖制备常用提取与纯化方法，特别是一些新技术的应用进展进行了综述。 １ 多糖的提取纯化 １．１常规方法提取 １．１．１原料预处理提取前，必须破坏或抑制共存的水解酶，可采用丙酮、乙醚、乙醇等低极性溶剂，以破坏水解酶并分离脂溶性杂质。１．１．２ 浸提一般采用不同温度的水或稀碱溶液提 取。浸提参数中，温度是影响多糖提取的主要因素，另外浸提固液比、浸提时间均影响提取率，可根据需要选取最佳工艺参数。１．１．３ 过滤或离心分离提取液有的可以直接过滤，有的因提取液较黏稠不易过滤，往往用离心法除去不溶物。１．１．４ 有机溶剂沉淀提取所得的滤液或上清液浓 缩，加２～５倍量的有机溶剂，得粗多糖沉淀。常用有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇及丙酮。 现有很多植物多糖的提取研究都是采取的常规 水提法：大麦［１］中活性多糖提取、大枣［２］多糖提取、老头草［３］中多糖的含量测定、乌龙茶［４］多糖提取等。 朱晓霞，罗学刚 （西南科技大学材料科学与工程学院，四川绵阳６２１０１０） 多糖提取与纯化技术应用进展 摘 要：多糖由于它们独特的功能和低毒性，在保健食品和药品发展方面具有广阔的应用前景。提取和纯化是制备多 糖的关键。目前用的提取方法有：常规水提法、超声波、微波辅助提取、超临界流体萃取；分离纯化技术有：色谱、膜分离。综述了多糖制备常用的提取与纯化工艺与新技术的应用进展，分析了它们的原理及优缺点并探讨了发展前景。关键词：多糖；提取；分离；纯化 ＰＲＯＧＲＥＳＳＩＮＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮＡＮＤＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ ＺＨＵＸｉａｏ－ｘｉａ，ＬＵＯＸｕｅ－ｇａｎｇ （ＳｃｈｏｏｌｏｆＭａｔｅｒｉａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｍｉａｎｙａｎｇ６２１０１０，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｈｉｇｈｖａｌｕｅｈａｓｂｅｅｎｆｏｕｎｄｆｏｒｔｈｅｂｉｏａｃｔｉｖｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｐｌａｎｔｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｈａｖｅｗｉｄｅｌｙａｎｄｐｒｏｍｉｓｉｎｇｆｏｒｅｇｒｏｕｎｄｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄｏｆｈｅａｌｔｈ－ｃａｒｅｆｏｏｄｓｔｕｆｆａｎｄｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｂｅｃａｕｓｅｏｆｉｔｓｌｏｗｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄｉｔｓｐａｒｔｉｃ－ｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｓｔｈｅｋｅｙｉｓｓｕｅｉｎｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ， ｔｈｅｃｏｍｍｏｎ－ｌｙｕｓｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｃｌｕｄｅｓｕｓｕａｌ－ｗａｔｅｒ，ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ，ｍｉｃｒｏｗａｖｅ，ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｐｕ－ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｃｌｕｄｅｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｍｅｍｂｒａｎｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｅｗｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｎｇａｎｄｐｕｒｉｆｙｉｎｇｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓａｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒｔｈｅｐｒｏｓｐｅｃｔｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｉｓｄｉｓｃｕｓｓｅｄ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ａｂｒｕｐｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
多糖分离纯化的基本原则和方法
多糖分离纯化的基本原则和方法 多聚糖(polysaccharide)，简称多糖，常由一百个以上甚至几千个单糖基通过糖苷键连接而成的，其性质已大不同于单糖，如甜味和强的还原性已经消失，广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中，是构成生命的四大基本物质之一，与生命功能的维持密切相关。近年来，大量研究表明多糖除了有增强免疫功能、抗肿瘤作用、抗氧化、抗衰老、消化系统保护作用的生物学效应外，还有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗辐射、抗凝血等作用。 1、基本原则 在不破坏多糖活性的前提下进行多糖的分离纯化。尽量不引入新的杂质，或引入的新杂志易于除去，如小分子盐类可经过透析作用除去，铵根离子可通过加热挥发除去等[1]。 2、分离纯化方法 多糖的生物活性倍受关注，但不少多糖的提取方法和工艺尚未成熟，基于效率、成本多方面的考虑，各种方法的开发、比较、分析是研究工作的焦点之一。目前多糖提取方法主要有溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声法、微波法、超临界流体萃取法。首先要根据多糖的存在形式及提取部位不同，决定在提取之前是否做预处理：提取时需注意对一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在用水提取前，应先加入甲醇或l：l的乙醇乙醚混合溶液或石油醚进行脱脂，而对含色素较高的根、茎、叶、果实类，需进行脱色处理。 2.1多糖的提取与分离方法 由于各类多糖的性质及来源不同，所以提取方法也各有所异，主要归纳为以下几类： 第一类难溶于水，可溶于稀碱液的主要是胶类，如木聚糖及半乳糖等。原料粉碎后用0.5mol/L NaOH水溶液提取，提取液经中和及浓缩等步骤，最后加入乙醇，即得粗糖沉淀物。 第二类易溶于温水，难溶于冷水的多糖，可用70~80℃热水提取，提取液用氯仿：正丁醇（4:1）混合除去蛋白质，经透析、浓缩后再加入乙醇即得粗多糖产物[2]。 第三类粘多糖的提取。在组织中，粘多糖与蛋白质以共价键结合，故提取
多糖的分离纯化及生理作用
多糖的分离纯化及生理作用 多糖包括植物多糖、动物多糖和微生物多糖。人们已发现多糖不仅是机体的能量来源和骨架成分，而月还具有多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用等多种生物活性。 多糖的提取和纯化 1. 多糖的提取 1.1 热水浸提法：其步骤为：原料→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥 首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2－3次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）。然后浓缩，再加入2－5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥（若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时，可直接冷冻干燥）,干燥后可得粉末状的粗多糖。 1.2 微波辅助提取法： 其原理为利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度，使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物质从基体或体系中分离出来，进入到介电常数小，微波吸收能力较差的萃取剂中。由于微波能极大加速细胞壁的破裂，因而应用于中草药中有效成分的提取能极大加快提取速度，增加提取产率。而且由于其选择性好，提取后基体能保持良好的性状，提取液也较一般的提取方法澄清。聂金源等在柴胡多糖和黄酮化合物的提取[18]中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较，发现微波辅助提取法所需时间最短（10min），多糖的提取率最高（28.46％）。 1.3 超声辅助法： 其原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取[16]。超声波辅助法与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点[17]。 1.4 索氏提取法： 将植物粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，60℃-90℃条件下提取至无色（一般为6小时）。过滤，滤渣挥发干燥完溶媒后加入80%乙醇，再提取6小时，过滤，滤渣乙醇挥发干燥后加蒸馏水。回流提取2次，趁热过滤，滤液减压浓缩，再除蛋白，醇沉，除色素。60℃干燥，称重。 1.5 醇提法： 先后将90%和50%乙醇加入植物粉末中，振荡充分再抽滤。滤液中加入足量无水乙醇，至于4℃冰箱中过夜。减压抽滤，再除去色素，得多糖粗品，在60℃通风干燥箱中干燥，再置干燥皿中恒重保存。 醇提法方法简单，易于操作，但提取率较低，乙醇使用量大，不宜大规模提取使用。 2.多糖的纯化方法纯化是将多糖混合物分离为单一多糖的过程，纯化的方法主要有以下几种： 2.1 分部沉淀法根据各种多糖在不同浓度的低级醇或丙酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出的沉淀，经反复溶解与沉淀后，直到测得的物理常数恒定（最常用的是比旋光度测定或电泳检查）。这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖。为
多糖各种提取方法
一、植物多糖的提取 1 溶剂提取法 1．1 水提法 水对植物组织的穿透力强，提取效率高，在生产上使用安全、经济。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。一般植物多糖提取采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去小溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍。但以根茎为主的植物体,细胞壁多糖含量高,热水直接提取率不高。此时为破坏细胞壁,增加多糖的溶出，有两种处理方法:一为酶解,二为弱碱溶解。 1．2酸碱提法 有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。但酸提法只在一些特定的植物多糖提取中占有优势，目前报道的并不多。而且即使有优势，在操作上还应严格控制酸度，因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂。 有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。采用的稀碱多位为0．1mol／L氢氧化钠、氢氧化钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。同样，碱提优势也是因多糖类的不同而异。与
酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。另外，稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅速透析，浓缩与醇析而获得多糖沉淀。
1．4 生物酶提取法 酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等。 1．5 超声提取法 超声波是一种高频率的机械波，其主要原理是利用超声波产生的“空化作用”对细胞膜的破坏，有利用植物有效成分的释放，而且超声波能形成强大的冲击波或高速射流，有效地减小、消除与水相之间的阻滞层，加大了传质效率，有助于溶质的扩散。另外，超声波的热效应使水温基本在57℃，对原料有水浴作用。超声波提取与传统的提取方法相比，有提取效率高、时间短、耗能低等优点。超声提取的影响因素有：超声时间、超声频率（一般低频中提取效率高，但也有例外）、料液比和温度等。 1．6 微波提取 微波是频率介于300MHz和300GHz之间的非电离电磁波，微波提取的原理是微射线辐射于溶剂并透过细胞壁到达细胞内部，由于溶剂及细胞液吸收微波能细胞内部温度升高，压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，位于细胞内部的有效成份从细胞中释放出来，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。微波技术应用于植物细胞破壁，有效地提高了收率。具有穿透力强、选择性高、加
柳茶多糖的分离纯化及气相色谱
【摘要】目的首次提取柳茶中的水溶性粗多糖并进行分离、纯化及组成分析。方法柳茶经热水提取、乙醇沉淀、Sevag法去蛋白、H2O2脱色，逆向流水透析得多糖精制品。将精多糖衍生化后运用气相色谱-质谱法对其化学成分进行分析。结果确定了柳茶中水溶性多糖分别由核糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，其中以核糖、葡糖糖、半乳糖为主。结论该方法简便、灵敏，可以准确测定出柳茶多糖中所含有的各种单糖。 【关键词】柳茶多糖; 纯化; 气相色谱-质谱; 单糖 柳茶为藏族民间常用药，以蔷薇科(Rosaceae)鲜卑花属(Sibiraea)植物窄叶鲜卑花Sibiraea angustata (Rehd.) Hand-Mazz. 和鲜卑花Sibiraea laecigata (L) Maxim.的枝叶及果序(带果实的果枝)入药，主要用于消食导滞、疏散风热;据藏药文献记载，柳茶主治热病和疫病[1]。现藏族民间常作茶饮，治疗食后腹胀等诸多原因引起的消化不良，每每见效。柳茶中除含有挥发油、微量元素外，通过实验发现还含有丰富的多糖。多糖作为提高机体免疫功能的保健品已被许多人接受，但许多多糖产品仅仅停留在保健品阶段，未能开发成药物，主要原因是多糖的分离纯化困难，技术不过关。因此本文旨在对柳茶多糖的提取、纯化、组分分析进行研究并对其营养保健功能进行探讨，以期为柳茶的开发及其综合利用提供参考。 一、仪器与材料 1.1 仪器UV-2450紫外分光光度计(日本岛津) ; NE2155电子天平(德国赛多利斯仪器公司);Agilent 5793I-6890气相色谱-质谱联用仪(GC-MS);SE-54弹性石英毛细管柱(50 m×0.25 mm id×0.50 μm);高纯氦(纯度≥99.999%);旋转蒸发仪(上海青浦泸西仪器厂)。 1.2 材料鲜卑花属植物叶采自甘肃省甘南藏族自治州合作市郊，海拔3 200 m以上。经兰州大学药学院生药学研究所杨永建教授鉴定其为蔷薇科(Rosaceae)鲜卑花属(Sibiraea)植物窄叶鲜卑花Sibiraea angustata (Rehd.) Hand-Mazz. 和鲜卑花Sibiraea laecigata (L) Maxim.的叶。 单糖标准品葡糖糖、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖标准品(Fluka公司)，盐酸羟胺、吡啶、三氟乙酸、乙酸酐、氯仿以及其他试剂等均为国产分析纯，蒸馏水为实验室自制。 二、方法 2.1 多糖的提取与纯化 2.1.1 粗多糖的提取取一定量的柳茶依次用石油醚、乙醚除去脂溶性杂质。加10倍量的水90～100℃提取3次，3 h/次，合并水提液，过滤。70℃水浴减压浓缩至适量，加入5倍量95 %的乙醇纯析，静置过夜，离心过滤，置真空冷冻干燥得柳茶多糖粗品。 2.1.2 粗多糖纯化[2]将多糖粗品溶于蒸馏水，去不溶物，按Sevag法(氯仿∶正丁醇=4∶1)脱蛋白，重复10次以上，然后移至透析袋中用去离子水逆流透析24 h，直至紫外光谱分析检测无蛋白吸收。以氨水调节pH为8，滴加H2O2，50℃保温脱色2 h，减压浓缩，加入5倍量的无水乙醇，静置过夜，离心收集沉淀，将沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚漂洗2次，冷冻干燥得去蛋白多糖纯品。 2.1.3 紫外光谱分析取柳茶多糖适量，加水溶解，配制成浓度为1.0 g/L的多糖水溶液，采用紫外可见分光光度法190～700 nm范围内扫描。光谱显示柳茶多糖具有多糖特征性的紫外吸收图谱仅在200 nm处有一锐细吸收峰，大于250 nm无明显的紫外吸收，是平坦的背景。结果表明，提取纯化的多糖中不含有核酸、蛋白质以及其他杂质成分。 2.2 柳茶多糖的气相色谱质谱测定 2.2.1 供试品溶液(糖腈乙酰酯衍生物)的制备称取20 mg柳茶纯化多糖样品溶于2 ml 2 mo1/L的TFA中，封管，于100℃水解6 h，减压除尽TFA。在水解产物中加入20 mg盐酸
分光光度法测定茶叶中多糖含量
1绪论 1.1 茶多糖的结构与功能 茶多糖是茶叶中极具开发价值的一种生理活性物质，是一种酸性糖蛋白,并结合有大量的矿质元素，称为茶叶多糖复合物，简称为茶叶多糖或茶多糖（Tea Polysaccharide）。其是蛋白部分主要由约20种常见的氨基酸组成，糖的部分主要由阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖等，矿质元素主要由钙、镁、铁、锰等及少量的微量元素，如稀土元素等组成。 现代药理研究证实，茶多糖具有降血糖、降血脂、降血压及减慢心率、耐缺氧的作用，同时茶多糖在抗凝血、防血栓形成、保护血相和增强人体非特异性免疫功能方面均有明显效果[1]。 1.2 茶多糖测定的现状 茶叶中多糖含量的测定对于提取茶多糖所用原料的选择及茶多糖提取工艺提取率高低的评价都具有重要的意义。汪东风等[2]研究表明对同一品种的红茶和绿茶，均为六级茶，茶多糖的含量，红茶为0.85％±0.10％，绿茶为1.41％±0.06％，但该研究是以葡萄糖作标准曲线，而实际上如王丁剐[3]、汪东风[4]等报道，茶多糖是由阿拉伯糖、核糖、木糖、甘露糖、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖等组成的杂多糖，其具体的单糖组成与茶叶的品种有关。而不同的单糖与蒽酮—硫酸试剂显色情况不同，不同单糖标准曲线的斜率不同，因而仅采用葡萄糖做标准的测定结果，会存在一定的误差，结果比实际含量偏低。 1.3 本文研究内容 本文用精制茶多糖测得茶多糖对葡萄糖的换算因子，然后将经前处理除杂后的茶样用水提取，蒽酮一硫酸法比色测定，对江西婺源不同茶场茶叶中多糖的含量进行了测定，并与其它产地、品种的茶叶进行了比较。
2 实验部分 2.1 实验仪器与材料 2.1.1 实验仪器 分光光度计，电子天平，水浴锅，旋转蒸发仪，真空干燥箱，离心沉淀机； 2.1.2实验试剂 蒽酮、浓硫酸、无水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正丁醇，以上试剂均为分析纯； 2.1.3 实验原料 江西婺源红碎茶、绿茶、分宜绿茶、福建安澳乌龙茶。 2.2 实验方法 2.2.1 实验原理 选用精致茶多糖测得茶多糖对葡萄糖的换算因子，然后将经前处理后的茶样用水提取，蒽酮—硫酸法比色测定，对不同茶场茶叶中多糖的含量进行测定。 2.2.2 茶叶多糖的提取与精制［5、6］ 称取已干燥的40目茶叶粉末20g，置索氏提取器中，加入石油醚(沸程60oC一90oC)lOOml，90oC 回流提取1h脱脂，抽滤，滤渣挥干溶剂后．加80％乙醇200ml，90oC水浴回流lh，重复提1次，双层滤布过滤，滤渣加400ml蒸馏水，沸水浴回流提取1h，间歇搅拌。双层滤布过滤，滤渣加200ml蒸馏水，沸水浴再回流提取1 h，间歇搅拌，过滤，合并两次滤液，离心分离(400Or/min，10min)，真空浓缩(60oC ，50r/min，真空度0. 095Mpa)至20ml,Sevage法除蛋白，反复进行三次至无蛋白层，然后用流动自来水透析48h，蒸馏水透析24h，透析液中加人无水乙醇使乙醇浓度达80％，于4oC冰箱中过夜醇沉，再离心分离(400Or/min，10min)，沉淀依次用无水乙醇丙酮、乙醚各洗两次，真空干燥(45oC，0.095Mpa)至恒重，即得精制茶多糖。称重，计算得率，备用。 2.2.3 标准曲线的绘制[7、8] 2.2. 3.1 标准溶液的配制 精密称取105oC干燥至恒重的葡萄糖标准品0.2508g，置于250ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，配成1.O03mg/ml的标准溶液，然后分别提取2.5ml、5ml、lOml、15ml、20ml标准溶液，置于100ml容量瓶中稀释至刻度，摇匀，配成系列标准溶液。
茶多糖的提取及其药理作用研究概况
茶多糖的提取及其药理作用研究概况 【摘要】本文综述了茶多糖的提取、分离及纯化方法，介绍了茶多糖的药理作用，尤其是茶多糖的降血糖机理，并重点阐述了近几年研究的热点，为今后进行更深入的研究提供了理论依据。 【关键词】茶多糖；降血糖；提取；药理作用 茶多糖（Tea Polysaccharide，简称TPS）是茶叶中重要的生理活性物质，在日本和中国民间早有用粗老茶治疗糖尿病的习惯，Isiguki等[1-2]将茶多糖配制成饮料供糖尿病患者饮用，可缓解症状。之后，国内外对茶多糖的结构及其生物活性的研究越来越多，研究证明茶多糖能降血糖、防糖尿病等广泛的病理作用，而且还能使血清凝集素抗体增加，从而增强机体免疫功能[3-7]。针对目前研究的热点，本文对茶多糖的提纯工艺和茶多糖的药理作用综述如下： 1 茶多糖的提取、分离、纯化 茶多糖的提取成功与否及其活性高低，直接影响到其药理作用，因此，茶多糖的提取及分离纯化的尤为关键。 1.1 提取方法 已有研究报道表明[5]，茶多糖的提取大多采用水提法，但也有酸水解法和碱水解法。并有实验结论证实[5]，水提法的适宜水温为55℃-90℃，浸提时间为30 min-90min，料液比为1：30左右。乙醇作为茶多糖常用的一种沉降剂，其浓度与提取液的浓缩程度是影响沉降效果的关键因素，浓度过低，多糖不能完全沉淀；浓度过高，则会导致其他成分一起析出，乙醇浓度在80%-90%范围内较好。 1.2 茶多糖的制备 先将茶叶磨碎，用80℃热水浸泡30 min后过滤除掉茶叶，浸泡液减压浓缩后，再加入3倍体积90%乙醇沉淀、离心得到沉淀物，沉淀物再用少量水溶解，重复乙醇沉淀一次，沉淀物用无水乙醇、丙酮、乙醚交替洗涤3次，水浴干燥，得茶多糖粗制品（CTPS）。茶多糖的纯化是采用Sevag方法除去蛋白质。经Sevag 法脱蛋白4～5次后，用蒸馏水透析24 h，然后经醇析，真空低温干燥可得到茶多糖（TPS）纯品。 1.3 茶叶产地、品种、加工工艺对茶多糖含量的影响 实验证明[7]，无论是粗多糖还是纯化多糖，各产地茶叶制备的绿茶，其多糖得率高于乌龙茶多糖，红茶多糖得率最低。粗多糖经脱蛋白后含量明显降低，下降幅度在60%-70%，主要原因是由于茶多糖是一种糖蛋白，在脱蛋白的同时带走大量的糖类，含量降低，不同产地、品种、加工工艺对茶叶的茶多糖含量、
多糖的提取和纯化精编版
多糖的提取和纯化 多糖的提取和纯化多糖的提取和纯化摘要本文较 详细地介绍了多糖的提取和纯化方法，为多糖的研究和生产提供参考依据。关键词多糖；提取；纯化；活性炭多糖（polysacharides，PS），又称多聚糖，是由10个以上的单糖通过苷键连接而成的，具有广泛生物活性的天然大分子化合物。它广泛分布于自然界高等植物、藻类、微生物（细菌和真菌）与动物体内。20世纪60年代以来，人们逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能[1]：(1)多糖可作为广谱免疫促进剂，具有免疫调节功能，能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病，甚至能抗AIDS病毒[2]。如甘草多糖具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用[10]，黑木耳多糖、银杏外种皮多糖和芦荟多糖可抗肿瘤和增强人体免疫功能[3-5]。(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗辐射，增强免疫功能等生物学作用[6]，麦冬多糖具有降血糖及免疫增强作用[7-8]，动物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能[9]。(3)多糖能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用[10]，银杏外种皮粗多糖具有抗衰老、抗过敏、降血脂、止咳祛痰、减肥等功能[11]。另外，多糖作为药物，其毒性极小，因而多糖
的研究已引起人们极大的兴趣。由于多糖具有的生物活性与其结构紧密相关，而多糖的结构又是相当复杂的，所以在这一领域的研究相对缓慢。但人们在多糖的分离提取与纯化方面已做出了不少工作。1. 多糖的提取[12]1.1 热水浸提法：1.1.1多糖提取条件的优选根据文献报道[13]：影响热水浸提多糖的因素主要有提取时间、提取次数、溶剂体积、浸提温度、pH值、醇析浓度和植物颗粒大小等。在试验前对上述多种因素利用正交实验法做出优选，才能选出最佳提取方案。1.1.2其步骤为：原料→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2－3次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）。然后浓缩，再加入2 －5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧
茶多糖的提取纯化研究
https://www.360docs.net/doc/bc18099477.html, 茶多糖的提取纯化研究 姜波，齐桂年，尹旭敏，王雪萍 （四川农业大学茶学系，四川雅安 625014） 摘要：茶多糖在成品茶中含量为1％左右，尤其是粗老茶中含量较高。现今，多糖的分离纯化有了很大进展，但是如何提高茶多糖分离纯化的效率却一直是个亟待解决的问题，而且茶多糖的含量与组成会随着提取方法和工艺的不同而有很大的差异。 关键词：茶多糖，提取，纯化 1. 引言 活性多糖专指具有某种特殊生物活性的多糖化合物，包含植物多糖、真菌多糖等。植物活性多糖中较为重要的一种是茶多糖，茶多糖广泛存在于茶叶中，尤其是粗老茶中含量较高[6]。 茶多糖(Tea polysaccharide，简称TPS)，在成品茶中含量为1％左右[7]，它是一类与蛋白质结合在一起的酸性多糖或一种酸性糖蛋白，具有许多特殊的生理功能[2]。近20年来，多糖的分离纯化、组成测定和结构分析都有了很大进展，但是如何提高茶多糖分离纯化的效率却一直是个亟待解决的问题，而且茶多糖的含量与组成[11]会随着提取方法和工艺的不同而有很大的差异。清水岑夫等[1]从茶叶冷水提取物中分离的茶多糖，分子量为40 000，由阿拉伯糖、核糖和葡萄糖以5．1：4．7：1．7比例组成；王丁刚等[9]提取的茶多糖分子量为91 000，由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖以0．23：1．04：0．62：2．43：1．00比例组成；汪东风等[3]用紫外、红外、气相色谱法分离的茶多糖分子量为107 000，由阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖以5．52：2．21：6．08：44．2：41．99比例组成。但至今茶多糖中单糖存在键型及其连接方式尚未明了[5]。2. 茶多糖的提取技术 2.1 茶多糖的提取方法 根据提取原料茶多糖含量、提取仪器试剂、提取步骤及提取过程的差异，TPS提取方法主要有以下几种：
植物多糖的功能..提取及纯化
植物多糖的功能 多糖与蛋白质一样，具有生物大分子的复杂结构，具有一定的生理和生物学活性，概括起来多糖的生物活性包括：免疫调节性、抗肿瘤活性、降血糖活性、降血脂活性、抗病毒活性、抗衰老活性(抗氧化活性)、抗疲劳、抗突变活性，除此之外，还具有其他生物活性，包括抗凝血、抗炎、抗菌、抗惊厥、镇静、止喘及降血压等作用。 植物多糖的提取 一、植物多糖的提取 1 溶剂提取法 1．1 水提法 水对植物组织的穿透力强，提取效率高，在生产上使用安全、经济。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。一般植物多糖提取采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去小溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍。但以根茎为主的植物体,细胞壁多糖含量高,热水直接提取率不高。此时为破坏细胞壁,增加多糖的溶出，有两种处理方法:一为酶解,二为弱碱溶解。 1．2酸碱提法 有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。但酸提法只在一些特定的植物多糖提取中占有优势，目前报道的并不多。而且即使有优势，在操作上还应严格控制酸度，因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂。 有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。采用的稀碱多位为0．1mol／L氢氧化钠、氢氧化钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。同样，碱提优势也是因多糖类的不同而异。与酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。另外，稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅
多糖的提取和纯化
多糖的提取和纯化目前，真菌多糖的提取可从子实体和采用深层培养发酵液的菌丝中分离获得，但以从子实体中提取多糖为主。首先是将子实体粉碎，加入甲醇或乙醇乙醚1:1混合液，水浴加热搅拌1一3小时除去表面脂肪。其次是用残渣提取多糖，常用的方法有不同温度下的水提法、稀酸提法、冷热稀碱提法。水提法采用的较多，适合于提取水溶性多糖。稀酸提取法适用于提取酸溶性多糖、时间宜短，温度不超过50℃，以防止糖昔键断裂。稀碱法适合于提取碱溶性糖。然后除去小分子杂质，常采用透析法，将多糖提取液置于半透膜透析袋中，逆向流水透析1一3天。第四步是沉淀多糖。大部分多糖在有机溶剂中的溶解度极小，所以可用有机溶剂来沉淀。常用4一5倍低级醇、丙酮，一般在pH=7.0左右沉淀多糖，制得粗多糖。最后是除去蛋白质。除去多糖中的蛋白质常用的方法是三氯醋酸法。得到的溶液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物或单一多糖。 多糖的纯化是将多糖混合物分离为单一的多糖。纯化方法很多，主要纯化方法有:(l)分步沉淀法根据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小而大加入这些醇或酮分步沉淀。此法适用于分离各种溶解度相差较大的多糖。(2)盐析法根据不同多糖在不同浓度盐中具有不同溶解度而分离。 纯度鉴定和分子量测定多糖纯度标准不能用通常化合物纯度标准来衡量，因为我们所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围内的均一组成。因此，测得的分子量一般为平均分子量。过去常用粘度法、蒸气压渗透计法、沉降法、超速离心法、光散射法等测定高分子化合物分子量的方法测定真菌多糖的分子量，但由于这些方法测定起来比较麻烦，且误差较大，现多数已不采用。目前实验室常用的方法为凝胶过滤法和高压液相色谱法，对于分子量小于1百万的多糖用高压液相法为最好。 1.2.1发酵、提取 取香菇465菌株斜面菌种接人摇瓶培养基中振荡培养，逐级扩大培养至10O0L，25℃下通 气培养72h，压滤，得香菇深层培养菌丝体。 上述菌丝体经水洗涤后，用3倍量热水(90一100℃)浸取3h，浸取液经浓缩加3倍量95肠乙 醇，离心得乙醇沉淀物一Le[‘’。 1.2。2分离、纯化 取Le上样于DEAE一纤维素柱上，用O。Olmol/L pH 6.95 Tris-HCI缓冲液洗脱，洗脱液分 部收集，分别用UV(280nm)和酚硫酸法测定其吸收值(A值)，合并吸收峰重叠的洗脱液，经浓 缩、透析、冻干得淡黄色絮状物Le一2· Le一2进一步用DEAE一纤维素(DE52型)分离，先用pH7.8的0.oosmol/L硼酸缓冲液洗脱， 后用含lmol/L NaCI的o.Zmol/L硼酸缓冲液洗脱.各洗脱液按上法用UV230nm和酚硫酸法 检测，分别收集既含肤又含糖的洗脱液.用o.005mol/L硼酸缓冲液洗脱的组分为Le一2一1，用含 lmol/L NaCI的硼酸缓冲液洗脱的组分称Le一2一2o 1.2.3鉴定 1.2.3.1纯度 (l)HPLC法将样品配成1%浓度后进样.进样量20召L。流动相:0.002mol/L NaAc;
多糖的提取分离方法
1、多糖的提取方法 生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3 大类。多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位,决定在提取之前就是否做预处理。动物多糖与微生物多糖多有脂质包围,一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂,释放多糖。植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类,在提取前,应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理,目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。 1.1溶剂法 1.1.1水提醇沉法 水提醇沉法就是提取多糖最常用的一种方法。多糖就是极性大分子化合物,提取时应选择 水、醇等极性强的溶剂。用水作溶剂来提取多糖时,可以用热水浸煮提取,也可以用冷水浸提渗滤,然后将提取液浓缩后,在浓缩液中加乙醇,使其最终体积分数达到70 %左右,利用多糖不溶于乙醇的性质,使多糖从提取液中沉淀出来,室温静置 5 h,多糖的质量分数与得率均较高。影响多糖提取率的因素有:水的用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。 水提醇沉法提取多糖不需特殊设备,生产工艺成本低,安全,适合工业化大生产,就是一种可取的提取方法。但由于水的极性大,容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来,从而使提取液存放时腐败变质,为后续的分离带来困难,且该法提取比较耗时,提取率也不高。 1.1.2酸提法 为了提高多糖的提取率,在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH 值下难以溶解,可用乙酸或盐酸使提取液成酸性,再加乙醇使多糖沉淀析出,也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。 由于H＋的存在抑制了酸性杂质的溶出,稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高,但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂,且酸会对容器造成腐蚀,除弱酸外,一般不宜采用。因此酸提法也存在一定的不足之处。 1.1.3碱提法 多糖在碱性溶液中稳定, 碱有利于酸性多糖的浸出,可提高多糖的收率,缩短提取时间,但提取液中含有其它杂质,使粘度过大,过滤困难,且浸提液有较浓的碱味,溶液颜色呈黄色,这样会影响成品的风味与色泽。 1.1.4超临界流体萃取法 超临界流体萃取技术就是近年来发展起来的一种新的提取分离技术。超临界流 体就是指物质处于临界温度与临界压力以上时的状态,这种流体兼有液体与气体的特点,密度大,粘稠度小,有极高的溶解,渗透到提取材料的基质中,发挥非常有效的萃取功能。而且这种溶解能力随着压力的升高而增大,提取结束后,再通过减压将其释放出来,具有保持有效成分的活性与无溶剂残留等优点。由于CO2的超临界条件(TC＝304.6 ℃,Tp＝7.38 MPa)容易达到,常用于超临界萃取的溶剂,在压力为8～40 MPa 时的超临界CO2足以溶解任何非极性、中极性化合物,在加入改性剂后则可溶解极性化物。 该法的缺点就是设备复杂,运行成本高,提取范围有限。 1.2酶解法 1.2.1单一酶解法 单一酶解法指的就是使用一种酶来提取多糖,从而提高提取率的生物技术。其中经常使用的酶有蛋白酶、纤维素酶等。蛋白酶对植物细胞中游离的蛋白质具有分解作用,使其结构变得松散;蛋白酶还会使糖蛋白与蛋白聚糖中游离的蛋白质水解,降低它们对原料的结合力,