蛋鸡网状内皮组织增生病病毒分离鉴定

ＳＵＮ ＨｏｒＩｇ—ｌｅｉ，ＱＩＮ Ｍｅｉ，ＸＩＡＯ Ｙｉ—ｈｏｎｇ，ＹＡＮＧ Ｆｅｎｇ，ＮＩ Ｗｅｉ，ＮＩＥ Ｌｉ，ＵＵ Ｓｉ—ｄａｎｇ’
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｇｎ‘ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉａｎ ２７１０１８，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｗａｓｔｉｎｇ，ｗｅｉｇｈｔ ｌｏｓｓ，ａｎｅｍｉａ ａｎｄ ｐｒｏｖｅｎｔｒｉｅｕｌｕｓ ｓｗｅＵｉｎｇ ｉｎ ｅｇｇ—ｔｙｐｅ ｃｈｉｃｋｅｎｓ Ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ Ｓｈａｈ·
２００８年１０月，山东某鸡场饲养的１１３０００只父母代海 兰蛋种鸡于育成前期出现进行性消瘦、贫血、生长发育不 良等症状，至７０日龄发病率达９０％。病鸡死淘率逐渐
升高，最终全群淘汰，死淘鸡主要表现腺胃极度肿胀，免 疫器官严重萎缩等特征。本研究利用ＥＬＩＳＡ、间接免疫 荧光、病毒分离鉴定、ＰＣＲ方法对该病进行综合诊断，证 明该病与鸡群早期感染网状内皮组织增wk.baidu.com病病毒有关。
１材料与方法 １．１发病鸡群２００８年１０月，山东省某鸡场饲养的 １１３０００只蛋种鸡于育成前期出现进行性消瘦、贫血、生长 发育不良等症状，至７０日龄时鸡群发病率高达９０％，病 鸡体重只有正常鸡的一半，最终该鸡群遭全部淘汰。该 鸡群一日龄接种马立克（ＭＤ）ＣＶｌ９８８／Ｒｉｓｐｅｎｓ株疫苗， 并按蛋鸡常规免疫程序进行其他疫苗的免疫。 １．２病料采集及处理取７只具有典型症状的病鸡颈 静脉放血致死，剖检、采集并保存腺胃、肠管、法氏囊、胸 腺、心、肝、脾、肺、肾等病料，一份固定于１０％福尔马林 中性缓冲液，一份保存于一７０℃冰箱用于病毒分离。于
与ＲＥＶ—ＨＡ株的同源性。综合诊断判定该病可能与鸡群早期感染致病力较强的ＲＥＶ有关。
关键词：海兰蛋鸡；网状内皮组织增殖病病毒（ＲＥＶ）；腺胃炎；病毒分离鉴定 中图分类号：￥８３１文献标识码：Ａ文章编号：１００１—８５８１（２０１０）０６—０１３７—０４
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｌａｙｅｒ Ｆｌｏｃｋｓ
ＲＥＶ—ＨＡ．Ｉｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｆｉｅｌｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｗ鸹ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ
Ｗａｓ ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ Ｗａｓ ｐｏｓｓｉ．
ｂｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＲＥＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｔ ｅａｒｌｉｅｒ ｓｔａｇｅ．
图１ 病鸡腺胃肿胀
２．２血清学检测 检测的４８份血清中２８份为ＲＥＶ抗 体阳性，阳性率高达５８．３％；ＡＬＶ—Ｊ、ＡＬＶ—Ａ／Ｂ抗体均 为阴性。 ２．３间接免疫荧光检测肝、脾、肾、腺胃等组织器官 ＲＥＶ特异性抗原检测呈阳性，肝内阳性信号散布整个肝 组织（图２Ａ），但未形成比较明显的灶状阳性信号；脾内 阳性信号主要沿窦状隙散在分布；腺胃内阳性信号主要 分布在黏膜固有层（图２Ｂ）及黏膜下层。
５６ ｏＣ消化１ ｈ，用苯酚一氯仿抽提，再加入１／１０体积的 乙酸钠和２倍体积的无水乙醇，沉淀用７０％乙醇洗涤一 次，自然干燥，加３０恤Ｌ双蒸水溶解，于一２０℃冷冻 保存。 １．５．３ ＰＣＲ反应 以１．５．２中提取的组织基因组ＤＮＡ 为模板，采用２５灿反应体系进行ＰＣＲ扩增。扩增条件 为：９５℃变性５ ｍｉｎ；９５℃３０ Ｓ，５２ ｏＣ １ ｒａｉｎ，７２℃ｌ ｍｉｎ， ３０个循环；７２ ｏＣ延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物在１％的琼脂糖 凝胶电泳上鉴定。 １．５．４ 目的基因片段克隆测序将ＰＣＲ产物回收后克 隆入ｐＭＤｌ８一Ｔ载体，转入ＤＨ一５仅感受态细胞，经蓝白 斑筛选的阳性克隆送交华大基因科技公司进行ＤＮＡ序 列测定。 ２结果 ２．１剖检变化病鸡极度消瘦，羽毛蓬乱，鸡冠苍白。 剖检可见腺胃肿大如球状（图１），腺胃壁显著增厚，变 硬，乳头堵塞，凹陷，可挤出乳白色脓样分泌物，有的见腺 胃黏膜出血，溃疡；肌胃萎缩，肌肉松软；胸腺及法氏囊严 重萎缩；个别病鸡。肾脏肿大，有尿酸盐沉积；盲肠扁桃体 肿大、出血，十二指肠黏膜增厚、出血，空肠和直肠及泄殖 腔有不同程度的出血；神经组织未见眼观病变。
ｄｏｎｇ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｄｕｒｉｎｇ ｌａｔｅ ２００８．Ｉｔ ｃａｕｓｅｄ ａｂｏｕｔ ９０％ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｏｆ １００００ ｂｉｒｄｓ ａｔ ｔｈｅ ａｇｅ ｏｆ ７０ ｄａｙｓ．４８ ｓｅｒｕｍ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｔｌｌｅ ｆｌｏｃｋ
ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｅｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＲＥＶ）ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｅｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＵＳＡ）ｔｅｃｈ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｈｙ—ｌｉｎｅ ｌａｙｅｒｓ；Ｒｅｔｉｃｕｌｃｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ；Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｐｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌｉｔｉｓ；Ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
禽网状内皮增殖病是由禽网状内皮增殖病病毒 （Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔ ｈｅｌｉｏｓｉｓ ｖｉｒｅｓ，ｒｔＥＶ）引起的以网状细胞 增生为主要特征的一组综合征，包括急性网状细胞增生 症、矮小综合征和淋巴组织及其他组织慢性肿瘤增生型 疾病…。我国大陆于１９８６年分离到了一株矮小综合征 毒株，命名为ＲＥＶ—ＣＡ５旧Ｊ。鸡感染该病毒后会造成严 重的特异性和非特异性免疫抑制，对其它病原体的抵抗 力减弱。对于ＲＥＶ的检测国外已经发展了一些方法：如 间接免疫荧光（ＩＦＡ）、病毒中和试验、酶联免疫试验、ＰＣＲ 法和核酸探针法¨Ｊ。鉴于ＲＥＶ在我国养禽业的危害严 重性越来越大，我国养鸡场有必要将ＲＥＶ的检测纳入日 常工作范畴，发展符合我国养禽业现实的ＲＥＶ检测、诊 断方法。
收稿日期：２０１０—０３—２７ 基金项目：山东农业大学博士基金项目；山东省自然科学基金项目（３１３６４）。 作者简介：孙洪磊（１９８３一），男，硕士研究生，研究方向：动物临床病理学。ｔ通讯作者：刘思当。
万方数据
１３８
江西农业学报
２２卷
发病鸡群中随机采集４８份血样，分离血清，ＥＩ．ＩＳＡ （ＩＤＥＸＸ公司）方法检测ＲＥＶ、禽白血病病毒（ＡＬＶ—Ｊ、 ＡＬＶ—Ａ／Ｂ）抗体。 １．３ 间接免疫荧光原位病原检测 取固定充分的待检 组织，按照常规方法制备４～５¨ｍ厚的组织切片，二甲 苯和梯度酒精脱蜡至蒸馏水。待检切片浸于封闭液中 ３０ ｍｉｎ，甩去封闭液，不经洗涤直接加ＰＢＳ稀释的单克隆 抗体１１８１１８（１：加）（ＲＥＶ单克隆抗体１１８１１８由山东农 业大学崔治中教授提供），３７℃孵育ｌ ｈ，ＰＢＳ（ｐＨ ７．２） 洗涤３次，每次５ｍｉｎ，再加入ＦＩＴＣ标记的兔抗鼠二抗 （１：２００稀释，Ｓｉｇｍａ公司），３７℃孵育１ ｈ，ＰＢＳ（ｐＨ ７．２） 洗涤３次，每次５ ｍｉｎ，滴加甘油缓冲液封片，置于荧光显 微镜下检测。如果细胞浆内出现绿色荧光，则判定为阳 性。同时取ＳＰＦ鸡组织作为阴性对照。 １．４病毒的分离和鉴定 １．４．１细胞培养和病料接种取１０日龄ＳＰＦ鸡胚（济 南斯帕法斯ｓＰＦ种鸡公司），按常规方法制备鸡胚成纤 维细胞（ＣＥＦ）。取冷冻保存的病料研磨过滤后接种于长 成单层的ＣＥＦ，置细胞培养箱培养８ ｄ。每份病料各接种 两个６０ ｍｍ的细胞培养皿，一个放置盖玻片用于间接免 疫荧光检测；另一个用于细胞基因组ＤＮＡ提取进行ＰＣＲ 检测。设不接病毒的正常细胞作为阴性对照。 １．４．２间接免疫荧光鉴定 取接种病料８ ｄ的细胞，先 用ＰＢＳ（ｐＨ ７．２）洗涤，然后用预冷的丙酮固定５ ｍｉｎ。 加入ＲＥＶ单抗（１：４０稀释），３７℃孵育３０ ｍｉｎ，ＰＢＳ（ｐＨ ７．２）洗涤３次，加入ＦＩＴＣ标记的兔抗鼠二抗（１：２００稀 释）３７℃孵育３０ ｒａｉｎ，ＰＢＳ（ｐＨ ７．２）洗涤３次，置荧光显 微镜下观察。 １．５ ＲＥＶ基因片段扩增 １。５．１引物设计与合成 根据ＲＥＶ ＨＡ９９０１株前病毒 基因组ＤＮＡ ｅｎｖ囊膜糖蛋白基因序列设计引物。正向 弓ｌ物（Ｐ１）：５’一ＡＧＣＴＡＧＧＣ：ＴＣＧＴＡＴＧＡＡ一３’；反向弓Ｉ物 （Ｐ２）：５’一ＴＡ７ｒｒＧＡＣｃＡＧＧＴＧＧＧＴＹＧ一３’。Ｐ１、Ｐ２分另４ 位于ＲＥＶ—ＨＡ株前病毒基因组ＤＮＡ序列６５０４—６５２０ 和６９４０一６９２３，引物由华大基因科技公司合成。 １．５．２模板的制备 接种病料的ＣＥＦ加入胰酶消化并 离心，ＰＢＳ洗涤一次，加入组织抽提缓冲液和蛋白酶Ｋ，
ｎｉｑｕｅ．Ｔｈｅ ｏｖｅｒａｌｌ ｓｅｒｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ＲＥＶ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ５８．３％（２８／鸽）．１ｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ＲＥＶ ｍｏｎｏｅｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅ．
ＲＥＶ ｖｅａｌｅｄ ａ ｄｉｆｆｕｓｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ
ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｌｉｖｅｒ．ｓｐｌｅｅｎ，ｋｉｄｎｅｙ ａｎｄ ｐｒｏｖｅｎｔｒｉｅｕｌｕｓ．Ｏｎ ｔｈｉｓ ｂａｓｉｓ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔＩｌｅ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ＷａＳ ｄｉ．
ＲＥＶ一姒．ＤＮＡｓ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ
ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＣＥＦｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｓ ＰＣＲ ｔｅｍｐｌａｔｅ．ａｎｄ ４３８ ｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ
Ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ．Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ＲＥＶ—ＨＡ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｆｉｅｌｄ ｓｔｒａｉｎｓ．ｎｅ
ａｇｎｏｓｅｄ船ＲＥＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｌｉｖｅｒ Ｗａｓ ｉｎｏｅｕｌａｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ＣＥＦ ｃｅｉｌｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｉｎｄｉｒｅｅｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｅｅｎｃｅ
ＲＥＶ ｗｉｔｈ
ｍｏｎｏｅｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ．Ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅ聊ａｎｄ
Ａ．肝脏内特异性免疫荧光信号４００。；Ｂ．腺胃黏膜固有层内特异性免疫荧光信号１００。；ｃ．腺胃阴性对照１００× 图２组织间接免疫荧光检测结果
万方数据
６期
孙洪磊等：蛋鸡网状内皮组织增生病病毒分离鉴定
１３９
２．４病毒分离鉴定荧光显微镜下观察，接种病鸡肝组 织的ＣＥＦ均能与ＲＥＶ单克隆抗体１１８１１８呈现特异性 荧光反应，阳性反应的细胞形态轮廓清晰，细胞质被染成 绿色，未接种病毒的ＣＥＦ阴性对照未被染色（图３）；提 取阳性ＣＥＦ基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ检测，出现与 预期条带大小一致的约４３８ ｂｐ的目的片段，阴性对照 ＣＥＦ提取的基因组ＤＮＡ未能检测到目的条带（图４）。
江西农业学报２０１０，２２（６）：１３７—１４０ Ａｃｔａ Ａｇｒｉｃｕｈｕｒａｅ Ｊｉａｎｇｘｉ
蛋鸡网状内皮组织增生病病毒分离鉴定
孙洪磊，秦梅，肖一红，杨凤，倪伟，聂丽，刘思当’
（ｔｌＪ东，农业大学动物科技学院，山东泰安２７１０１８）
摘要：山东某鸡场饲养的１００００只父母代海兰蛋种鸡于育成前期出现进行性消瘦、生长发育不良等症状；剖检以腺胃肿 胀、淋巴器官萎缩为特征，至７０日龄发病率达９０％；经ＥＬＩＳＡ方法检测抗体及间接免疫荧光原位病原检测证明该病与网状内 皮组织增殖病病毒（ＲＥＶ）感染有关。取７只病鸡肝脏研磨处理后接种鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ），用ＲＥＶ单抗１ｌＢｌｌ８进行间接 免疫荧光检测，结果均呈阳性；根据ＲＥＶ—ＨＡ株前病毒基因组ＤＮＡ ｅｎｖ囊膜糖蛋白基因序列设计引物，提取阳性ＣＥＦ基因 组ＤＮＡ作为模版，ＰＣＲ扩增后得到４３８ ｂｐ的目的片段；ＰＣＲ产物测序结果比对显示，该毒株与其他中国野毒株的同源性高于