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重组anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒

的构建及其在Jurkat细胞株中的表达*

胡永仙1，俞康1△，谭映霞2，沈志坚1，钱红兰1，梁彬1，单大铭3

(1.温州医学院附属第一医院血液内科，2.医学科学研究所，浙江温州 325000；

3.美国华盛顿大学Bio-Rad实验室主任)

【摘要】目的：构建表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ重组非复制型逆转录病毒，转染Jurkat 细胞株使其表达目的蛋白。方法：采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/CD80的真核逆转录病毒载体pLNCX质粒上，转染PA 317细胞株，收获上清液获非复制型逆转录病毒，感染NIH 3T3细胞株，用PCR、流式细胞术检测目的基因在NIH 3T3细胞的表达情况，确定病毒滴度。挑取高滴度的包装细胞株收获病毒,感染Jurkat细胞,经G418筛选细胞，用RT-PCR检测目的基因表达情况。结果：经酶切及测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20scFv/CD80/CD28/ζ的成功构建；用PCR能够从逆转录病毒感染的NIH 3T3细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段；流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白；经RT-PCR，能够从转染的Jurkat细胞株中扩增出1条与目的基因大小一致的DNA片段。结论：成功构建高滴度表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒，并能在Jurkat细胞中表达目的蛋白。

【关键词】单链抗体；逆转录病毒； PA 317细胞；基因表达

【中图分类号】R73-3 【文献标识码】 A 【文章编号】 1000-6834

Construction of recombinant retroviruses expressing anti-CD20 SCFV/CD80/CD28/ζ gene and expression in JURKAT cell line

HU Yong-xian1, Yu kang1 ,TAN Yin-xia2 , SHEN Zhi-jian1, QIAN Hong-lan1,

LIANG Bin1 ,SHAN Da-ming3

(1. Department of Hematology, Wenzhou Medical College Affiliated First Hospital, Wenzhou, 32500, China;

2. Institute of Medicine;

3. Clinical laboratory, Bio-Rad laboratories Incorporation, California, USA)

【ABSTRACT】Objective:To construct recombinant retroviruses expressing anti-CD20 scFv/ CD80/CD28/

ζgene and detect its expression in Jurkat cells. Methods: CD28-ζcDNA were amplified from plasmids pBULLET and inserted into pLNCX vector that contained anti-CD20 scFv/CD80 gene. The recombinant plasmids were transfected into PA 317 cells. Retroviruses were harvested from culture medium of PA 317 cells.Then NIH 3T3 were transfected with retroviruses. Objective gene expression was determined by PCR and FACS. Jurkat cells were transfected with highest titer of retroviruses and resistant clones were obtained by G418 selection. Objective mRNA was determined by RT－PCR. Results:The recombinant eukaryotic vector was constructed successfully by PCR、enzyme digestion analysis and objective gene was amplified from NIH 3T3 cells transfected with retroviruses by PCR ; FACS showed that objective protein could be expressed in NIH 3T3 cells. objective gene was amplified from Jurkat cells transfected with retroviruses by RT－PCR. Conclusion: Recombinant retrovirus expressing anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ gene was successfully constructed and objective protein could be expressed in Jurkat cells.

【KEY WORDS】 Single chain fragment；Retrovirus； PA 317 cells； Gene expression

*

【基金项目】浙江省自然科学基金资助项目(302781)

【收稿日期】【修回日期】

△【通讯作者】 Tel：；E-mail：

机体抗肿瘤免疫主要是细胞免疫，而肿瘤细胞一般不表达或低表达B7分子及其他黏附分子，不能与CD28相互作用，从而难以诱导肿瘤特异性细胞免疫，使肿瘤逃避宿主免疫杀伤作用。为此，我们利用anti-CD20单链抗体（scFv）、CD80穿膜蛋白及T细胞活化信号CD28-CD3ζ构建表达pLNCX/anti-CD20scFv /CD80/CD28/ζ的非复制型高滴度逆转录病毒，感染Jurkat细胞使其表达目的蛋白，为以后该逆转录病毒转染原代T淋巴细胞从而制备CD20靶向性嵌合锚定T细胞奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

含anti-CD20 scFv/CD80的pLNCX质粒由华盛顿大学单大铭博士惠赠，含CD28-ζ链的质粒pBULLET由德国科隆大学肿瘤研究所Hinrich Abken博士惠赠，所有RT-PCR试剂、PCR试剂、T4连接酶、DNA Ladder均购自Promeg公司，引物均由北京赛百盛公司合成，基因测序由上海联合基因公司完成，Topo TA cloning kit、质粒抽提及胶回收试剂盒和转染试剂盒Lipofectin2000均采用美国Invitrogen生物公司，所有流式细胞检测试剂均购自BD公司，RPMI 1640和DMEM购自Gibco公司，Jurkat、PA 317、NIH 3T3细胞株购于中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，菌种DH5α由本实验室保存。

1.2 引物的设计合成

按pBULLET上的CD3ζ-CD28cDNA序列设计引物，上游引物5’-ATTATTATCGATAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCC,下游引物5’-ATTATTATCGA TTTAGCGAGGGGGCAGGGCCTG，5’端分别设计有ClaⅠ的酶切位点。

1.3 重组表达载体pLNCX/anti-CD20scFv/CD80/CD28/ζ构建及鉴定

以pBULLET质粒为模板,通过上下游引物进行PCR扩增反应,反应条件为94℃ 5 min，94℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共25个循环，最后再72℃延伸10 min，扩增产物回收纯化后与pCR-TOPO-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α,克隆筛选，挑取白斑摇菌提取质粒，行ClaⅠ单酶切及电泳鉴定，酶切阳性者送上海联合基因公司测序,将测序正确的pCR-TOPO/CD28/ζ载体行Cla Ⅰ单酶切，酶切产物回收与线性真核逆转录病毒表达载体pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80连接，转化大肠杆菌DH5α,挑取菌落送上海联合基因公司测序,与已知的序列分析比较。