分子印迹聚合物简介

3、分子印迹聚合物制备方法
3.1 整体印迹 将印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂按一定比例溶解在惰性溶剂 中，然后移入一玻璃安培瓶中，采用超声波脱气，然后通入氮气以除氧， 在真空下密封安培瓶，经加热或紫外光照射引发聚合得到块状聚合物。 块状聚合物经粉碎、研磨、筛选等过程获得合适大小的粒子，洗脱除去 模板分子。 Hawkin等以异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) 标记的白 蛋白为模板蛋白, 丙烯酰胺和N, N ‘-亚甲基双丙烯酰胺分别为功能单体和 交联剂, 用整体印迹法制备印迹材料。共聚焦显微镜图片显示, 标记了荧光 的模板蛋白均匀分布于分子印迹凝胶骨架材料中, 材料经10% 十二烷基硫 酸钠(sodiu dodecylsulfate, SDS)/10% 醋酸溶液洗涤后荧光消失，证明SDS溶 液可以使印迹蛋白变性并将其脱除。 Ye等设计了新型功能单体，可以通过金属协同作用与模板蛋白的特定 氨基酸序列结合，以此构造更均一的结合位点，并在一定程度上减少非 特异性吸附。N-(4-乙烯基）-苯甲基亚胺基双醋酸（N-（4-vinyl)-benzyl iminodiacetic acid,VBIDA)是一种金属螯合单体，它可与二价铜离子螯合作 为桥梁，再通过铜离子与蛋白表面暴露的组氨酸相互作用形成复合物。 用EDTA将模板蛋白脱除，从而在材料上留下结合位点。
分子印迹聚合物简介
主要内容
一 、分子印迹基础知识 二 、文献介绍 三、最近实验情况
一、分子印迹基础知识
1、分子印迹技术 分子印迹技术是当前发展高选择性材料 的主要方法之一，其原理是模仿自然界抗 原-抗体反应机理，在聚合物材料中引入分 子识别位点，制备在空间和结合位点上与 特定目标分子相匹配的、具有特定预定选 择性的高分子化合物—分子印迹聚合物。
Su等选用甲基丙烯酸为功能单体，聚乙二醇400二甲基丙烯酸酯为交联 剂，用微接触印迹法制备了卵清蛋白印迹薄膜。印迹薄膜的AFM图像显示， 材料上分布有直径约34nm的空穴，材料经蛋白重结合后图像表明卵清蛋白 以直径为32~36nm的蛋白簇形式重结合与表面的空穴中。
生物分子相互作用分析 (biomolecular interaction analysis) 中常 使用一种基于表面等离子共振技术(surface plasmon resonance, SPR) 的生物传感分析技术。实验时先将一种生物分子固定于传感器芯片上, 使与之相互作用的另一生物分子甚至是细胞、病毒等的溶液流经该芯片。 当两者发生相互作用时, 芯片表面溶液会发生折射率的改变, 从而引起共 振角的变化, 可实现实时跟踪检测生物分子间结合与解离过程的变化及其 相互作用的强弱
Qin等以溶菌酶为模板蛋白，N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺和VBIDA为 功能单体，用冷冻聚合法制得印迹溶菌酶的热敏大孔水凝胶。这种智 能水凝胶对模板蛋白表现出很强的吸附能力，印迹因子可达7.87，并 在多种蛋白的混合溶液中对模板蛋白实现成功分离。
Brown等用溶胶-凝胶法制备无定形聚硅氧烷印迹材料，用无定形硅 印迹溶菌酶多肽序列（16-residue peptide lysozyme C,1.8 kDa)识 别位点实际就相当于识别整个分子，与传统的有机材料相比，首先小 段多肽与单体材料有更强和更具特异性的相互作用，以此减少非特异 性吸附并增强材料对模板的亲和力，其次，小段多肽在有机试剂中相 对稳定，因而其有机试剂也可作为聚合的介质对模板蛋白结合力强， 选择性好，蛋白进出材料骨架速度快，此种方法相当于抗原决定基法。
印迹纳米粒
Hoshino 等用沉淀聚合法制备两亲性多肽蜂毒肽为模板的聚合物 纳米粒。沉淀聚合法制备条件温和，材料聚合过程中无需有机试剂 或加热过程。由于Mel具两亲性，倾向于停留在聚合物-水相的界面 上，在此位点上，Mel既能辅助材料的聚合，又能在材料上创建与 之互补的特异性结合位点，在一定程度上达到“表面印迹”的效果。
3、氨基wk.baidu.com烷单体种类对MIPs选择性的影响
APTMS同APTES做功能单体相比，对模板蛋白的印迹效果好，且对竞 争蛋白的Q值小。溶胶凝胶是以硅原子为中心，经过双原子亲核取代 反应形成的。在双原子亲核取代反应中，官能团-OC2H5同-OCH3相比反 应活性更大，从而加速水解和缩聚步骤，使形成的溶胶凝胶MIP结构更 规则，识别位点更有序。MIPs对模板分子的选择性和亲和性不仅是因 为MIPs中含有可以进行专一反应的结合位点，更为重要的是功能单体 在MIPs上形成了高度有序的结构。
二 文献介绍
（一）、氨基硅球表面印迹牛血清白蛋白分离条件的初步探 索》 文献探讨了识别蛋白质分子过程中是何种作用力起主 导作用。选择无机前驱体、氨基硅烷和烃基硅烷为功能单 体，牛血清白蛋白为模板分子，牛血红蛋白和溶菌酶为竞 争蛋白，采用固定模板蛋白表面印迹的方法在氨丙基衍生 的硅球表面制备了溶胶-凝胶的MIPs。
Li 等将高度交联的壳聚糖微球作为“核”通过可逆的席夫碱反 应共价连接模板蛋白BSA，最后在此多糖-蛋白的界面上通过溶胶-凝 胶过程覆盖一层聚硅氧烷的“壳”。用乙二酸破坏席夫碱从而将模板 蛋白从“核”上脱除，而“壳”上则将模板的大小、形状及空间构象 保留下来。此法制备的微球表面具有较粗糙的多孔结构。扫描电镜图 像显示，印迹微球表面形成大量分布均匀、网状连接的空穴。BET氮 气吸附试验结果表明，作为支撑基质的壳聚糖微球BET表面积为 41.25m2·g-1平均孔径为8.7 nm。而“核-壳”型印迹微球的BET 表面 积为48.65 m2·g-1,平均孔径达43.2 nm。表面积和孔径的增加提示了 印迹位点的形成。 Tan 等[19]用微乳液聚合法制备超顺磁性亚微粒。预先制备 Fe3O4 磁性纳米粒, 将功能单体甲基丙烯酸甲酯和交联剂乙二醇二 甲基丙烯酸分散在油相中, 用微乳液聚合法制备表面印迹核糖核酸 酶A(ribonuclease A, RNase A) 的亚微粒。与非印迹材料相比, 印 迹材料在混合蛋白溶液中对模板蛋白有很好的选择性。
4、硅烷单体的比例对MIPs吸附性能的影响
实验中选择烃基硅烷、氨基硅烷和无机前驱体四乙氧基硅烷( TEOS) 3种单体。 氨基硅烷主要通过氢键与模板蛋白作用, 烃基硅烷主要通过疏水力与模板蛋白作用, 通 过优化二者的比例发挥疏水力和氢键的协同作用, 产生对模板分子最好的特异性识别; 并且在制备M IPs时加入15% TEOS, 此功能单体起一定的交联作用, 使制备过程形成 极有规则又适宜结合模板蛋白的孔穴。实验考察了不同比例的氨基硅烷与烃基硅烷对 模板蛋白QM IP的影响。结果显示, 随着氨基硅烷比例的增加, 模板蛋白的QM IP减小。这 是因为氨基硅烷本身带有的氨基会与硅球表面的醛基反应形成亚胺键, 阻止了模板蛋白 与醛基的进一步结合, 使得QM IP减小; 而随着烃基硅烷比例的增加, 模板蛋白的QM IP逐 渐增大, 当二者之比为1. 5 /1时, QM IP达到最大值。 综合考虑上面两种因素对于M IPs吸附性能的影响, 在实验中选择烃基硅烷单体与 氨基硅烷单体的比例为1..1, M IPs配方为OTMOS..APTES..TEOS摩尔比是 42. 5 ： 42. 5：15。
1、印迹聚合物对不同蛋白质分离选择性的评价
取M IPs和N IPs各0. 1 g置于离心管中, 分别加入1mL 0. 5 g /L各蛋白质溶液 ( pH 7. 0, 0. 01mo l/L磷酸盐缓冲液), 室温下振荡吸附3 h。将离心管于离心 机中4000 r /m in离心3m in后, 取上层清液用紫外吸收法测定蛋白质的含量, 根据吸附前后蛋白质浓度的变化、溶液体积和聚合物的质量计算吸附量 (Q )。Q 定义为每单位质量( g )聚合物的吸附量: Q = (C0 - C t ) V /m ( 1) C0 为初始蛋白质浓度( g /L), C t 为上清液中蛋白质浓度( g /L), V 为蛋白 质溶液体积(mL) , m 为印迹聚合物质量( g)。 印迹聚合物对不同蛋白质分离选择性用印迹因子(α)和选择因子(β)来评 价。定义为 α = QM IP /QN IP ( 2) QM IP和QN IP分别为印迹聚合物和非印迹聚合物对蛋白质的吸附容量。 β 定义为: β = α模板蛋白/ α竞争蛋白 ( 3) α模板蛋白和/ α竞争蛋白分别为模板蛋白和竞争蛋白的印迹因子。
El kirat 等首先对玻璃板进行硅烷化，用双功能交联剂将模板蛋白接枝与其上， 继而在表面进行单体材料丙烯酰胺的聚合，由此制得二维结构印迹材料。该研 究小组首次用AFM对材料进行表征。AFM对材料表面的局部图像显示，印迹薄 膜上分布有许多与模板蛋白大小形状互补的小孔穴，而非印迹薄膜图像模糊， 无明显凹痕。小组以细胞色素c为模板，并将模板蛋白细胞色素c共价结合与 AFM的探针上，借助力-距离曲线探测出其在纳米尺度的范围内与印迹材料的 特异性结合力在85~95pN之间。将非模板蛋白牛血清白蛋白共价结合与探针上 作为对照，结果发现探针与印迹材料没有特异性相互作用。将连接了模板单板 的探针与非印迹材料相互作用也得到同样地结果。证明模板与印迹位点具有特 异性亲和力。
2 、分子印迹技术基本原理
分子印迹就是将模板分子与功能单体通过共价、非共价 或金属协同作用形成预聚合物，在交联剂的作用下功能单体 发生聚合，将模板分子固定在聚合物中，最后脱除模板分子， 即聚合物材料上留下与模板分子在大小、形状和官能团的方 向上都互补的空穴结构。空穴不仅保留了与模板分子化学结 构互补的官能团的有序排列，也维持了它的整个空间构象， 所以当材料再次遇到模板分子时，可发生特异性的结合。
2、烃基硅烷单体的种类对MIP选择性的影响
分别比较了PTMOS、HTMOS、PhTMOS、OTMOS为单体的MIP 的分离选 择性。单体PhTMOS主要以π-π作用和蛋白结合，而PTMOS、HTMOS及 OTMOS是通过疏水力与模板分子作用。实验结果显示，无论以何种单 体为材料制备的MIP都对模板蛋白具有选择性吸附，这说明无论是疏 水力还是π-π作用在识别蛋白中都有一定贡献。制备MIP的分离选择 性的强弱顺序为OTMOS>HTMOS >PTMOS,这说明碳链的长度越长，疏水 性越大，对模板的分离选择性就越强。 然而当由众多弱作用力总体产生的强作用被几个强的结合点代替 时MIP的特异性会降低。实验中，由PhTMOS制备的MIPs选择性优于 PTMOS，但不如HTMOS和OTMOS制备的MIPs,说明疏水作用比π-π作用 对MIPs特异性作用贡献大。原因可能有a. PhTMOS与蛋白质上的芳香 族氨基酸发生π-π作用，而多数蛋白含有的芳香族氨基酸很少，对 于含有上百个氨基酸的蛋白质来说，不可避免会造成一定程度的非特 异性结合;b. π-π作用是一种短程作用力，只有在蛋白质与MIPs近 距离接触时才会产生；而疏水力无方向性，作用快速，对结合蛋白质 这种体积庞大的分子更有利。
整体印迹法工艺虽然简单，但后续处理复杂 耗时，所得材料需经研磨和过筛才能得到所需 粒径范围的颗粒，并不适合工业化生产。另外， 此种方式制得的材料外形不规则，限制了其在 色谱和固相萃取领域的应用。最重要的是，整 体聚合时不可避免地会有大量的印迹位点分布 于材料内部，不利于蛋白质的进出。
3.2 表面印迹 在聚合物的表面或近表面构造模板蛋白的结合位点称为“表面印迹”。与 整体印迹旨在构造蛋白特异性三维结构不同的是，表面印迹的特点是在材料 的表面构建蛋白的“二维印迹”。这样的二维阴极材料从某种程度上解决了 生物大分子难以进出聚合物材料的问题，可大大缩短蛋白扩散进入材料并达 到平衡的时间。然而，与“三维印迹”材料性比，“二维印迹”材料可能会 出现对模板蛋白选择性降低的问题。
Tan 等以甲基丙烯酸甲酯为功能单体, 乙二醇二甲基丙烯酸为交联剂, 用微乳液 (W/O/W 复乳)聚合法制备了印迹RNase A 的纳米粒。该法中使 用了较高浓度的SDS 和聚乙烯醇作为乳化剂。作者认为, 当两亲性的蛋白 被加入预聚合微乳液后, 蛋白会吸附于表面活性剂形成的胶束中并被分配 到油-水两相的界面上。聚合反应引发后,蛋白便被“束缚”在胶束的表面 了。研究表明, 蛋白和表面活性剂的相互作用有助于蛋白停留在纳米粒表 面, 然而太剧烈的作用却会导致蛋白明显的构象变化, 甚至变性, 造成错 误的印迹。