氨基酸的测定方法

肽键
蛋白质水解就是使蛋白质逐渐降成分子量越来越小的肽段， 破坏肽键， 直到最后成为氨基酸的混合物。 （2）氨基酸分离原理 氨基酸是两性电解质，在水中既起酸（质子供体）的作用，也起碱（质子受体）的作用。 氨基酸在溶液中的存在形式：
氨基酸分离：
（2）氨基酸与茚三酮反应原理
3.试剂 除注明外全部试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。 （1）6 mol/L（0.5%巯基乙酸）盐酸溶液：优级浓盐酸与水以体积 1 比 1 混合，加入巯基乙酸 5 mL 混匀。 （2）0.02 mol/L 的盐酸溶液：吸取 1 mL 的 6 mol/L 盐酸溶液，加入 300 mL 的蒸馏水，混匀即可。 （3）BRIJ-35 溶液：25 g 溶于 100 mL 蒸馏水中。 （4）缓冲溶液：（参考日立 L-8900 氨基酸自动分析仪） 三菱化学公司生产的 MCI○L-8500 系列缓冲溶液，或根据下表配制缓冲溶液
PH-3 B3 0.20 1.02 700 13.31 — 3.74 12.80 4.0 — 5.0 4.00 4.0 1.0 0.1
PH-4 B4 1.20 1.06 700 26.67 — 54.35 6.10 — 5.0 — 4.00 4.9 1.0 0.1
PH-RG B6 0.20 1.00 700 — 8.00 — — 100.0 — — 4.00 1.0 0.1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
蒸馏水（约） 柠檬酸钠（二水） 氢氧化钠 氯化钠 柠檬酸（一水） 乙醇 苯甲醇 硫代双乙醇
BRIJ-35 溶液 PH（标称）
总计（校准） 辛酸
注：上表仅供参考。根据不同的仪器和不同的色谱柱，需要调整缓冲溶液的配方。 （5）茚三酮溶液： 日本和光纯药工业公司成套茚三酮试剂，或根据下表配制茚三酮试剂 容器 步骤 试剂 乙二醇独甲醚 茚三酮 氮气起泡，分解 硼氢化钠 氮气起泡 密度 蒸馏水 醋酸钠 冰醋酸 乙二醇独甲醚 总计 氮气起泡 密度 蒸馏水 乙醇 总计 密度 （6）氮气 （7）标准溶液配制 购买的氨基酸原液（Fluka AAS18）中每种氨基酸的浓度为 2.50 μmol/mL。 计量 单位
R
名称 容器 钠浓度 N 密度
PH-1 B1 0.16 1.02 mL g g g g mL mL mL mL L mL 700 6.19 — 5.66 19.80 130.0 — 5.0 4.00 3.3 1.0 0.1
PH-2 B2 0.20 1.02 700 7.74 — 7.07 22.00 20.0 — 5.0 4.00 3.2 1.0 0.1
1 2 3
氨基酸标准液中吸取 2mL，用 0.02 mol/L 盐酸稀释定容至 50 mL。每 20 μL 溶液中，每种氨基酸含量 为 2 nmol，稀释后标准于冰箱中冷藏，保存期约 1 个月。 也可根据下表配制
标准名称
称样量
定容体积
标准原液 浓度
分子量
吸取体积
稀释体积
定量管
上机浓度
mg ASP THR SER GLU GLY ALA VAL MET ILE LEU TYR PHE LYS NH3 HIS ARG PRO CYS
液转至 50 mL 容量瓶中，用去离子水多次冲洗水解管，合并洗液定容至刻度，用滤纸过滤，收集滤液。 （2）抽干稀释定容 吸取 1 mL 滤液至 10 mL 抽真空集液管中，在 40~50℃下用真空泵抽干。残留物用 1～2 mL 水溶解， 再抽干，反复进行 2 次，最后抽干。用 PH2.2 缓冲溶液稀释定容，上机。 （3）仪器测定 仪器测定条件（参照日立 L-8900 氨基酸自动分析仪）： 分析柱：树脂 2619，4.6×60 mm 柱； 除氨柱：树脂 2650，4×50 mm 柱 流 柱 速：A 泵 0.400 mL/min；B 泵 0.350 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
ul 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20
n mol/20ul 2.000 2.000 2.000 2.000 2.000 2.000 2.000 2.000 2.000 2.000 2.000 2.000 2.000 4.000 2.000 2.000 4.000 2.000
根据氨基酸的测定可以计算出蛋白质的含量。 下面举例说明： 氨基酸分析结果
nmoL/50μL 氨基酸 Asp Thr Ser Glu Gly Ala Val Met Ile Leu Tyr Phe Lys NH3 His Arg Pro TRP CYS 校正因子 2.01E-06 1.90E-06 1.95E-06 1.80E-06 1.36E-06 2.55E-06 2.39E-06 1.79E-06 2.51E-06 1.91E-06 1.60E-06 1.92E-06 1.70E-06 6.52E-06 1.53E-06 1.71E-06 8.14E-06 1.37E-06 8.27E-07 峰面积 3002224 1427294 1928822 6306894 3935580 1941687 1394969 630994 828536 2659797 837641 1247083 1922471 2038206 1017793 2340188 521459 2088543 2954688 摩尔浓度 6.03 2.71 3.75 11.35 5.34 4.95 3.33 1.13 2.08 5.07 1.34 2.39 3.26 13.30 1.56 4.01 4.25 2.86 2.44 分子量 133.1 119.1 105.1 147.1 75.1 89.1 117.2 149.2 131.2 131.2 181.2 165.2 146.2 17.0 155.2 174.2 115.1 204.23 240.30 ng/50μL 浓度 803.19 322.81 394.29 1669.94 401.08 440.81 390.25 168.71 272.74 665.13 243.30 394.94 476.41 226.02 241.37 697.92 488.62 584.61 587.13 μg/50μL 浓度 0.803 0.323 0.394 1.670 0.401 0.441 0.390 0.169 0.273 0.665 0.243 0.395 0.476 0.226 0.241 0.698 0.489 0.585 0.587 μg/50μL 上机浓度 34.96 34.96 34.96 34.96 34.96 34.96 34.96 34.96 34.96 34.96 34.96 34.96 34.96 34.96 34.96 34.96 34.96 202.00 174.80 % 分析结果 2.30 0.92 1.13 4.78 1.15 1.26 1.12 0.48 0.78 1.90 0.70 1.13 1.36 0.65 0.69 2.00 1.40 0.29 0.34 不含 NH3 24.36 23.71 % 合计
氨基酸的测定方法—茚三酮柱后衍生法
北京市营养源研究所 叶颖慧 参考方法：GB/T 5009.124-2003 食品中氨基酸的测定 从各种生物体中发现的氨基酸有 180 多种，但参与蛋白质组成的常见氨基酸或称基本氨基酸有二十二 种。除脯氨酸外，这些氨基酸在结构上的共同点是与羧基相连的 α-碳原子上都有一个氨基，因而称 α-氨基 酸。结构通式如下：
1.适用范围 本方法适用于食品中蛋白质水解得到的天冬氨酸、苏氨酸等十六种氨基酸的测定；不适用于蛋白质含 量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食品中氨基酸测定。 2.原理 食物中的蛋白质经盐酸水解，成为游离氨基酸，再用氨基酸自动分析仪进行测定。 氨基酸分析仪是应用离子交换层析原理，离子交换柱树脂为磺酸型强阳性阳离子交换树脂。氨基酸与 树脂中的交换基团进行离子交换，用不同 PH 的缓冲溶液进行洗脱时，因交换能力的不同而将氨基酸混合 物分开，一般是酸性和含羟基的氨基酸最先被洗脱下来，然后是中性氨基酸，最后是碱性氨基酸。分离流 出色谱柱的氨基酸在 135℃下与茚三酮反应生成紫色物质茚二酮炔一茚二酮胺（DYDA），通过分光光度 计测定其含量。其最低检出限为 3 pmol。 （1）蛋白质水解原理 蛋白质是由氨基酸通过肽键首尾相连而成的共价多肽链。一分子氨基酸中的羧基与另一分子氨基酸分 子的氨基脱水而形成的酰胺叫做肽，其形成的酰胺键称为肽键。 R O R' R O R' - H2O NH2 CH C OH + NH2 CH COOH NH2 CH C NH CH COOH
（3）标准液的储存：氨基酸标准液应放置于 4℃冰箱内保存，失效的标准液蛋氨酸、酪氨酸等的峰高 和峰面积都减小而氨峰变高，峰面积变大。 （4）缓冲溶液的配制：配制缓冲溶液时，使用一级水，过 0.45μm 滤膜后使用。试剂尽可能采用优级 纯试剂或进口试剂。配制缓冲溶液只要称量准确，一般不需调整 PH 值。 （5）茚三酮试剂的配制： ①乙二醇独（单）甲醚易氧化产生过氧化物，因此不宜使用大包装的试剂，如：每瓶 2L 或 4L。检查 乙二醇独（单）甲醚的方法：取乙二醇独（单）甲醚 4mL 加入等体积的 4%的 KI 水溶液振摇，无颜色即 可。 ②茚三酮为微黄色的粉末，其中不能带有粉红色或粉红色颗粒。 ③由于日立 835-50 氨基酸分析仪茚三酮与茚三酮缓冲溶液是配在一瓶中的，混合后，试剂容易变化，因此 每次不宜配的过多，并且通入氮气放在冰箱内储存。 附： 酸水解蛋白质的氨基酸共有 18 种，除了上述的 16 种氨基酸还包括胱氨酸和色氨酸。 胱氨酸在盐酸水解过程中，水解为半胱氨酸，而半胱氨酸不与茚三酮作用，不能产生颜色反应。采用 过甲酸氧化法先将样品中的胱氨酸、半胱氨酸氧化为半胱磺酸，再用盐酸水解，在氨基酸分析仪上分离染 色，测定含量。 色氨酸在蛋白质酸水解的过程中损失很大，极易被分解。因此采用碱水解蛋白质，得到色氨酸。测定 有两种方法， 一、直接测定色氨酸的天然荧光。在蛋白质水解液中，只有色氨酸和酪氨酸可以检测到荧光。在 pH 为 11 时，色氨酸的荧光强度比酪氨酸大 100 倍，且两种氨基酸的荧光相差 40nm，利用此特点，可在有大 量酪氨酸的存在下，检测色氨酸的含量。 二、碱水解后，调整 PH 为中性，在氨基酸分析仪上分离，与茚三酮染色，测定含量。 三、蛋白质与氨基酸测定结果的数据关系 蛋白质由氨基酸组成，但二者的测定结果不能完全吻合，原因是 1.蛋白质和氨基酸测定各自在系统误差 2.定氮法测定的得到的蛋白质还包含非蛋白氮，再乘以系数得到的结果不能真实反应蛋白质的含量， 因此为粗蛋白。
33.28 29.77 26.27 36.79 18.77 22.27 29.28 37.31 32.80 32.80 45.30 41.30 45.68 26.75 52.43 52.68 57.54 60.08
称取样品（视蛋白含量）20~100 mg 于水解管中，精确至 0.0001 g ，加入 6 mol/L（0.5%巯基乙酸） 盐酸溶液 10 mL，液体样品可加入等体积的浓盐酸，放入冰水中冷冻 3~5 分钟，抽真空充氮气，重复三次 后，在氮气保护下封管。封管后放入 110℃±1℃的恒温箱中水解 22 小时，取出冷却。打开水解管，将水解
R1—茚三酮
1 2 3 4 5
979 39 5 81 30 0.96 336 272 123 401 1000 10 0.96 950 50 1000 1.00
mL g min mg min mL g mL mL mL min mL mL mL
R2—茚三酮缓冲溶液
1 2 3 4 5 6
R3—5%乙醇溶液
4.仪器 （1）真空泵。 （2）恒温箱。 （3）水解管。 （4）真空泵。 （5）氨基酸自动分析仪。 5.操作步骤 （1）酸水解
mL 250 250 250 250 250 250 250 250 250 250 250 250 250 250 250 250 250 250
mg/mL 0.13312 0.11908 0.10508 0.14716 0.07508 0.08908 0.11712 0.14924 0.1312 0.1312 0.1812 0.1652 0.18272 0.107 0.20972 0.21072 0.23016 0.24032
反应柱温度：135℃ 分光光度计：570 nm,440 nm 仪器分析程序：参照各仪器公司说明书 6.计算
C0 A FVM V0 A 0 样品中氨基酸含量X（g/100g） 100 m 109 式中： X —— 样品中氨基酸含量，g/100g； C0 —— 进入仪器测定的标准液中氨基酸的摩尔数，nmol/20μL； A0 —— 标准峰面积； A —— 样品峰面积； F —— 样品稀释倍数； V —— 水解后样品定容体积，mL； M —— 氨基酸分子量； m —— 样品质量，g； V0 —— 进样量，20μL； 109 —— 将样品含量由 ng 换算成 g 的系数。
g/mol 133.11 119.08 105.06 147.14 75.07 89.06 117.1 149.22 131.18 131.18 181.2 165.2 182.7 53.5 209.7 210.7 115.08 240.3
mL 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
7.色谱图
采用日立 L-8900 氨基酸分析仪
采用日立 835-50 氨基酸分析仪
8.注意事项
（1）称样量：对于上机的氨基酸样品浓度，L-8900 推荐的最适浓度范围为 0.4~10nmol/20μL，当样品 浓度超过 20nmol/20μL 时，铵盐可能会使得反应柱柱压增高。对已知蛋白质含量的样品，按照 16 种氨基 酸净含量总和为 2μg ~10μg/20μL 的浓度计算称样量。对于未知浓度的样品，取两支试管分别加入 0.1 mL 的样品水解液和 0.1 mL 标准溶液，再向两管内均加入 1 mL 茚三酮试剂和 1mLPH1 缓冲溶液，在沸水中加 热 3 min，测定 570 nm 处的吸光度，根据吸光度，计算样品稀释倍数。 （2）水解剂的选择：最常用的水解剂是盐酸，它对蛋白质中二十种氨基酸有强的水解能力。但是对 于各种不同特殊要求的分析，需要根据某些氨基酸的特点选用不同的方法，如果对胱氨酸和蛋氨酸有特殊 要求，则要在酸中加入巯基乙酸。如果要提高酪氨酸的回收率，则要加入酚类化合物。