人子宫内膜基质细胞及上皮细胞的分离
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5 Y ikork ala O , Cacciat ore B, Paak kari I, et al. T he longt erm ef f ect s of oral and t rans dermal post menopausal hormone r eplacement t herapy on nit ric oxide, endot helin1, p rost acylin, and t hromboxane. Fert il St er il, 1998, 69: 883.
生殖医学杂志 1999 年 12 月第 8 卷第 4 期
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三、讨论 1. 绝经后 妇女 ET 变 化: 本 研究结 果中绝 经后 妇
女 ET 水 平明显高于 绝经前妇女 , 与文 献[1] 报 道一致。 绝经后 妇女 ET 水平升高 与雌激素 水平降低有 关。本 研究 T C 升高 者( C 组 ) ET 水平也 明显升高, 且二者 呈 显著相 关性。提示高血 脂者 ET 升高可 能与高胆固 醇 血 症所 致血 管内 皮损 伤、刺激 血管 内皮 细胞 释 放 ET 有关。业已证明, ET 可引起血管强烈收缩, 并刺激血管 平滑肌细胞 DN A 合成[ 2] 。近年来发现 ET 可作为心血 管疾病的独立危险因素[ 3] 。因此, 绝经后妇女 ET 水平 的升高无疑是诱发心血管疾病的重要因 素。
一、材料及方法 1. 标本 来源: 选 自 1996 年 10 月～ 1997 年 12 月 在山东省立 医院妇产科因子宫 肌瘤做子宫切除术 病例 10 例, 年龄 36～48 岁, 月经 周期 规律 ( 28～32 天) , 术 前 3 个月未 用激素, 病理 检查为 增殖期 至早分 泌期 子 宫内膜。 2. 子 宫内 膜 上 皮细 胞 及 基 质细 胞 的 分 离: 参 照 K evin 等[1] 方 法加以 改良: 术后立 即刮取 子宫内 膜, 置
6 Beat o M . Gene regu lation by st eroid horm on es . Cel l, 1989, 56: 335. ( 收稿: 1998-11-06 修回: 1999-07-05)
人子宫内膜基质细胞及上皮细胞的分离
张丽凤 苏应宽 盖 凌 朱 王春霞
为获得 供人胚胎联合培养 的人子宫内膜上皮 和基 质细 胞标本, 必须 进行人 子宫内 膜上皮 和基质 细胞 的 分离和培养。为此, 我们对传统的 K ev in[1] 方法进 行改 进, 现介绍如下。
于含无 菌 D -Hank's 液的 100 ml 三 角烧 瓶, 立即 送实 验室。将子宫内膜在无 菌的 D-Hank's 液中洗 两次, 冲 去血液细胞及粘液, 用眼科剪将组织剪 成 1～2 mm3 的 碎块, 400 x g 离心 10 分钟除去多余 血细胞。组织中加 入 0. 25% 胰酶( T r ypsin, Sig ma) , 37℃消化 30 分钟, 轻 轻吹打。消化后, 大部分基质细 胞分散成单个细 胞, 或 小的团块, 而上皮细胞呈大的团块。细胞悬液依次通过 孔径为 105 及 88 m 尼龙网, 基质细胞通过网 眼, 而上 皮细 胞 留 在 网上, 分 出富 含 基 质 细胞 及 上 皮 细胞 的
降, 从而减轻了对内皮细胞的损伤及刺 激有关。
参考文献
1 Wil cox JG , St ancz yk FZ, Hatch IE, et al . Endot helin levels decrease af ter oral an d nonoral est rogen in post menopau sal women w ith increased cardiovascular ris k f actors . Fert il St eril , 1997, 67: 273.
3. 细胞培养: 将基质细 胞及上皮 细胞分 别接种 于 塑料 培养板或培养瓶中 ( N U N C) , 细胞浓度为 5×106/ ml, 每两天换 液一次, 培养液中 含 10% 的小牛 血清( 山 东省医学科学院提供) , 5～6 天细胞 基本长满瓶底。用 0. 25% T r ypsin 与 0. 02% EDT A ( 1∶1 混合, Sig ma) 消 化贴 壁的细 胞, 洗 涤两次, 继续 按上 述浓 度接种 培养, 部分用盖 片法培养, 细胞长满瓶底后取 出盖片, 其它 仍 消化再接种或冷冻保存。
4 Pol derm an K H, St ehouw er CD , V an K amp G J, et al. Inf luence of s ex hormon es on plasma endot helin level s. A nn Int ern M ed, 1993, 118: 429.
4. 细胞纯度鉴 定: 分 别取出 盖片, 甲醛固 定 30 分 钟, 固定前用 PBS 洗两次, 用 5% 甲醇 H2O 2 处理 20 分 钟, 以去除内源性过 氧化物酶活性, 分别加入鼠抗人 波 形蛋白单抗( 武汉博士德公司) 及兔抗人 细胞角蛋白 多 抗 ( 北 京 中 山 生 物 技 术 有限 公 司 SA N T A G RU Z 产 品 ) , 4℃过夜, 加生 物素 ( Biot in) 标记 的二 抗, 37℃、30 分 钟, 加三 抗, 37℃、30 分 钟, ( 以上 所用 ABCkit 分 别 购 自武 汉博士 德及 北京 中山公 司) , 用 0. 5% T r it on-X 100 处理 3 秒钟, 加 DA B 显色液, 显微镜下观察显色结 果, 直 到显 色满 意为 止, 阳 性结 果为 细 胞浆 染成 棕 黄 色。水洗, 梯度酒精脱水, 二甲苯透 明, 中性 树胶封片。 高倍镜下计数 200 个细胞, 计算阳性细胞百分率。
众所周知, 成纤维细胞具有 快速贴壁的特性, 这种 特性被用于分离纯化上皮细胞及其他非成纤维细
胞[2] , 应 用选择性贴壁方法 纯化的上皮 细胞纯度 高, 基 质细胞污染的机会少。
在接种后, 上皮细胞仍呈团 块状, 在生长 过程中逐 渐 分 散, 细 胞 呈 多 角 状, 细 胞 之 间 可 出 现 拉 网 现 象 ( netting ) , 用抗细胞角蛋白抗体检测, 阳性率> 90% 。
本课题为山东省自然基金( 9648) 资助项目 作者单位: 250002 济南 山东省计划生育 科研所( 张丽 凤、盖 凌) ; 山东省立医院( 苏应宽、王春霞、朱 )
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ห้องสมุดไป่ตู้
生殖医学杂志 1999 年 12 月第 8 卷第 4 期
部分。将 富含 基 质细 胞 的 部分 在 DM EM / F12 ( 1∶1) ( G IBCO ) 中 洗两 次, 将细 胞悬 浮在 2 ml 的 培养 液中, 小心 铺在 含有 10 ml 培 养液的 离心 管液 面上, 密封 管 口, 在 37℃( 垂直) 、置 5% CO2 培养箱中 30 分钟, 沉淀 后吸出上层 8 ml, 缓慢移至另一离心管中, 400 x g 离心 10 分钟, 收集细胞, 细胞再悬 浮在 2 ml 培养液中, 重复 上 述 步 骤, 然 后 , 将 细 胞 通 过 37 m 的 尼 龙 网, 用 0. 04% 的台盼蓝 计算活细胞数。富含上 皮细胞的团 块 在 D-Hank's 液中洗两次, 再用 0. 25% T r ypsin 消化 15 ～ 20 分钟, 通 过 88 m 尼 龙网, 在网 上收 集上 皮细 胞 团块, 加 0. 25% T r ypsin 继续消化 30～45 分钟, 显微镜 下见到 50～100 个细胞的团块时, 停止消化, 用沉降 法 收集 上 皮 细 胞。将 细 胞 接 种 到 塑 料 瓶 或 培 养 皿 中 ( N U N C) , 37℃、5% CO 2 培 养 30～ 40 分 钟, 基 质细 胞 迅速 贴壁, 而上皮 细胞则 悬浮在 培养 液中, 重复 一次, 即 可 得 到高 纯 度 的 上皮 细 胞, 细 胞 经 离 心、洗 涤, 用 0. 04% 台盼蓝计算活细胞数。
三、讨论
10 年来, 为提高 助孕技术中 胚胎的 卵裂率 和移植 成功率, 人 们采用胚胎联合培 养、辅助孵 化和卵浆内单 精子注射技术等 方法取得巨大成功。在 胚胎联合培养 中, 获 取供体 外联合 培养的 人子宫 内膜上 皮和基 质细 胞是重要的步骤 。本 研究采用酶消化、过滤、速度沉降 及选择 性贴壁 方法分离 的上皮 细胞及 基质 细胞, 是一 种简单、快速、有效 的方法。我们发现, 在消化过 程中, 大约 30% 的细 胞丢失, 然而, 剩下 的细胞 活性高, 事实 上, 在 整个分 离过程 中, 上 皮细胞 始终 呈团 块状, 其活 性较高。
m l 的浓度接种, 换液同细胞培养。 以上 所 用 培养 液 及 D -Hank's 液 均 为无 菌, 内 含
100 U / ml 青霉素、100 mg / m l 链霉素。 二、结果
1. 应用酶消化结合物理方法所分离的子宫内膜基 质细胞 及上皮 细胞纯度 高, 应用特 异性上 皮细胞 及基 质细胞标志波形蛋 白单抗及细胞角蛋白 多抗分别做免 疫组织化学染色, 其阳性率> 90% 。
2. 雌激 素 与 ET 的关 系: 有 研究 表明, 女性 血 浆 ET 含量明显低于男 性, 提示雌 激素参与 ET 的释放 调 节[ 4] 。对绝经后妇女的研究 表明, 无论短期 ( 1 个月) 还 是长期补充雌激素( 1 年) , 均可引起 ET 变化[1, 5] 。本组 绝经后妇女 ER T 治疗前及治疗 4 周后 结果表明, 雌激 素可明显降低 ET 水平, 而具有 保护心血管作用。雌激 素 对 ET 的 调节机 制尚 不清楚, 对 血管 内皮细 胞雌 激 素受 体测定 表明, 内皮细 胞胞浆 含有大 量高亲 合力 的 受 体[ 6] , 研究还 表明, 雌 激素可 通过 调节内 皮间 反应、 抗氧化 等调节内皮细胞功 能[1] 。高血脂 是心血管疾 病 的主要危险因素。高血脂者 ERT 治疗后 ET 水平降低 更为 明显, 其原因 可能与 应用雌 激素后 胆固醇 水平 下
2. 细胞培养: 子宫内膜 基质细胞: 培养 2 天在倒置 相差显微镜下可 见细胞呈极性生长, 培养 3～4 天细胞 基本长满瓶底, 仍呈极性生长, 细胞与细 胞间界限不明 显。子宫内膜上皮细 胞: 培养 5 天 细胞呈多角状 生长, 细胞与细胞间界限清楚。复 苏后细胞接种后, 细胞存活 率> 40% , 培养 3～4 天后 两种细 胞基 本长 满瓶底, 细 胞呈融合状, 细胞形态不变。
5. 细胞冷 冻及复 苏: 消 化后 的细 胞用培 养液 洗 2 次, 以 10% 的二甲基亚砜 做保护剂, 细胞浓度为 107 以 上, 4℃20 分钟, 然后移至- 20℃20 分钟, - 80℃过夜, 或直接置入液氮罐中保存, 保存时间为 1 个月以上。细 胞复苏: 从液氮中取 出细胞, 立即 置于 37℃水浴 中 7～ 10 分钟, 不断 摇动 冷冻 管, 用培 养液 洗 2 次即 按 106/
3 Berman A , Edw ards BS , Hal et t JM , et al. Circulat ing and t issu e end ot helin im munoreactivit y in advanced at herosclerosis . N Engl J M ed, 1991, 325: 997.
2 Hirat a Y , T ak agi Y , Fuku da Y , et al. E ndot hel in is a pot ent mit ogen f or rat vascular smoot h mu scl e cell s. A t her os cl ers is, 1989, 78: 225.
生殖医学杂志 1999 年 12 月第 8 卷第 4 期
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三、讨论 1. 绝经后 妇女 ET 变 化: 本 研究结 果中绝 经后 妇
女 ET 水 平明显高于 绝经前妇女 , 与文 献[1] 报 道一致。 绝经后 妇女 ET 水平升高 与雌激素 水平降低有 关。本 研究 T C 升高 者( C 组 ) ET 水平也 明显升高, 且二者 呈 显著相 关性。提示高血 脂者 ET 升高可 能与高胆固 醇 血 症所 致血 管内 皮损 伤、刺激 血管 内皮 细胞 释 放 ET 有关。业已证明, ET 可引起血管强烈收缩, 并刺激血管 平滑肌细胞 DN A 合成[ 2] 。近年来发现 ET 可作为心血 管疾病的独立危险因素[ 3] 。因此, 绝经后妇女 ET 水平 的升高无疑是诱发心血管疾病的重要因 素。
一、材料及方法 1. 标本 来源: 选 自 1996 年 10 月～ 1997 年 12 月 在山东省立 医院妇产科因子宫 肌瘤做子宫切除术 病例 10 例, 年龄 36～48 岁, 月经 周期 规律 ( 28～32 天) , 术 前 3 个月未 用激素, 病理 检查为 增殖期 至早分 泌期 子 宫内膜。 2. 子 宫内 膜 上 皮细 胞 及 基 质细 胞 的 分 离: 参 照 K evin 等[1] 方 法加以 改良: 术后立 即刮取 子宫内 膜, 置
6 Beat o M . Gene regu lation by st eroid horm on es . Cel l, 1989, 56: 335. ( 收稿: 1998-11-06 修回: 1999-07-05)
人子宫内膜基质细胞及上皮细胞的分离
张丽凤 苏应宽 盖 凌 朱 王春霞
为获得 供人胚胎联合培养 的人子宫内膜上皮 和基 质细 胞标本, 必须 进行人 子宫内 膜上皮 和基质 细胞 的 分离和培养。为此, 我们对传统的 K ev in[1] 方法进 行改 进, 现介绍如下。
于含无 菌 D -Hank's 液的 100 ml 三 角烧 瓶, 立即 送实 验室。将子宫内膜在无 菌的 D-Hank's 液中洗 两次, 冲 去血液细胞及粘液, 用眼科剪将组织剪 成 1～2 mm3 的 碎块, 400 x g 离心 10 分钟除去多余 血细胞。组织中加 入 0. 25% 胰酶( T r ypsin, Sig ma) , 37℃消化 30 分钟, 轻 轻吹打。消化后, 大部分基质细 胞分散成单个细 胞, 或 小的团块, 而上皮细胞呈大的团块。细胞悬液依次通过 孔径为 105 及 88 m 尼龙网, 基质细胞通过网 眼, 而上 皮细 胞 留 在 网上, 分 出富 含 基 质 细胞 及 上 皮 细胞 的
降, 从而减轻了对内皮细胞的损伤及刺 激有关。
参考文献
1 Wil cox JG , St ancz yk FZ, Hatch IE, et al . Endot helin levels decrease af ter oral an d nonoral est rogen in post menopau sal women w ith increased cardiovascular ris k f actors . Fert il St eril , 1997, 67: 273.
3. 细胞培养: 将基质细 胞及上皮 细胞分 别接种 于 塑料 培养板或培养瓶中 ( N U N C) , 细胞浓度为 5×106/ ml, 每两天换 液一次, 培养液中 含 10% 的小牛 血清( 山 东省医学科学院提供) , 5～6 天细胞 基本长满瓶底。用 0. 25% T r ypsin 与 0. 02% EDT A ( 1∶1 混合, Sig ma) 消 化贴 壁的细 胞, 洗 涤两次, 继续 按上 述浓 度接种 培养, 部分用盖 片法培养, 细胞长满瓶底后取 出盖片, 其它 仍 消化再接种或冷冻保存。
4 Pol derm an K H, St ehouw er CD , V an K amp G J, et al. Inf luence of s ex hormon es on plasma endot helin level s. A nn Int ern M ed, 1993, 118: 429.
4. 细胞纯度鉴 定: 分 别取出 盖片, 甲醛固 定 30 分 钟, 固定前用 PBS 洗两次, 用 5% 甲醇 H2O 2 处理 20 分 钟, 以去除内源性过 氧化物酶活性, 分别加入鼠抗人 波 形蛋白单抗( 武汉博士德公司) 及兔抗人 细胞角蛋白 多 抗 ( 北 京 中 山 生 物 技 术 有限 公 司 SA N T A G RU Z 产 品 ) , 4℃过夜, 加生 物素 ( Biot in) 标记 的二 抗, 37℃、30 分 钟, 加三 抗, 37℃、30 分 钟, ( 以上 所用 ABCkit 分 别 购 自武 汉博士 德及 北京 中山公 司) , 用 0. 5% T r it on-X 100 处理 3 秒钟, 加 DA B 显色液, 显微镜下观察显色结 果, 直 到显 色满 意为 止, 阳 性结 果为 细 胞浆 染成 棕 黄 色。水洗, 梯度酒精脱水, 二甲苯透 明, 中性 树胶封片。 高倍镜下计数 200 个细胞, 计算阳性细胞百分率。
众所周知, 成纤维细胞具有 快速贴壁的特性, 这种 特性被用于分离纯化上皮细胞及其他非成纤维细
胞[2] , 应 用选择性贴壁方法 纯化的上皮 细胞纯度 高, 基 质细胞污染的机会少。
在接种后, 上皮细胞仍呈团 块状, 在生长 过程中逐 渐 分 散, 细 胞 呈 多 角 状, 细 胞 之 间 可 出 现 拉 网 现 象 ( netting ) , 用抗细胞角蛋白抗体检测, 阳性率> 90% 。
本课题为山东省自然基金( 9648) 资助项目 作者单位: 250002 济南 山东省计划生育 科研所( 张丽 凤、盖 凌) ; 山东省立医院( 苏应宽、王春霞、朱 )
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ห้องสมุดไป่ตู้
生殖医学杂志 1999 年 12 月第 8 卷第 4 期
部分。将 富含 基 质细 胞 的 部分 在 DM EM / F12 ( 1∶1) ( G IBCO ) 中 洗两 次, 将细 胞悬 浮在 2 ml 的 培养 液中, 小心 铺在 含有 10 ml 培 养液的 离心 管液 面上, 密封 管 口, 在 37℃( 垂直) 、置 5% CO2 培养箱中 30 分钟, 沉淀 后吸出上层 8 ml, 缓慢移至另一离心管中, 400 x g 离心 10 分钟, 收集细胞, 细胞再悬 浮在 2 ml 培养液中, 重复 上 述 步 骤, 然 后 , 将 细 胞 通 过 37 m 的 尼 龙 网, 用 0. 04% 的台盼蓝 计算活细胞数。富含上 皮细胞的团 块 在 D-Hank's 液中洗两次, 再用 0. 25% T r ypsin 消化 15 ～ 20 分钟, 通 过 88 m 尼 龙网, 在网 上收 集上 皮细 胞 团块, 加 0. 25% T r ypsin 继续消化 30～45 分钟, 显微镜 下见到 50～100 个细胞的团块时, 停止消化, 用沉降 法 收集 上 皮 细 胞。将 细 胞 接 种 到 塑 料 瓶 或 培 养 皿 中 ( N U N C) , 37℃、5% CO 2 培 养 30～ 40 分 钟, 基 质细 胞 迅速 贴壁, 而上皮 细胞则 悬浮在 培养 液中, 重复 一次, 即 可 得 到高 纯 度 的 上皮 细 胞, 细 胞 经 离 心、洗 涤, 用 0. 04% 台盼蓝计算活细胞数。
三、讨论
10 年来, 为提高 助孕技术中 胚胎的 卵裂率 和移植 成功率, 人 们采用胚胎联合培 养、辅助孵 化和卵浆内单 精子注射技术等 方法取得巨大成功。在 胚胎联合培养 中, 获 取供体 外联合 培养的 人子宫 内膜上 皮和基 质细 胞是重要的步骤 。本 研究采用酶消化、过滤、速度沉降 及选择 性贴壁 方法分离 的上皮 细胞及 基质 细胞, 是一 种简单、快速、有效 的方法。我们发现, 在消化过 程中, 大约 30% 的细 胞丢失, 然而, 剩下 的细胞 活性高, 事实 上, 在 整个分 离过程 中, 上 皮细胞 始终 呈团 块状, 其活 性较高。
m l 的浓度接种, 换液同细胞培养。 以上 所 用 培养 液 及 D -Hank's 液 均 为无 菌, 内 含
100 U / ml 青霉素、100 mg / m l 链霉素。 二、结果
1. 应用酶消化结合物理方法所分离的子宫内膜基 质细胞 及上皮 细胞纯度 高, 应用特 异性上 皮细胞 及基 质细胞标志波形蛋 白单抗及细胞角蛋白 多抗分别做免 疫组织化学染色, 其阳性率> 90% 。
2. 雌激 素 与 ET 的关 系: 有 研究 表明, 女性 血 浆 ET 含量明显低于男 性, 提示雌 激素参与 ET 的释放 调 节[ 4] 。对绝经后妇女的研究 表明, 无论短期 ( 1 个月) 还 是长期补充雌激素( 1 年) , 均可引起 ET 变化[1, 5] 。本组 绝经后妇女 ER T 治疗前及治疗 4 周后 结果表明, 雌激 素可明显降低 ET 水平, 而具有 保护心血管作用。雌激 素 对 ET 的 调节机 制尚 不清楚, 对 血管 内皮细 胞雌 激 素受 体测定 表明, 内皮细 胞胞浆 含有大 量高亲 合力 的 受 体[ 6] , 研究还 表明, 雌 激素可 通过 调节内 皮间 反应、 抗氧化 等调节内皮细胞功 能[1] 。高血脂 是心血管疾 病 的主要危险因素。高血脂者 ERT 治疗后 ET 水平降低 更为 明显, 其原因 可能与 应用雌 激素后 胆固醇 水平 下
2. 细胞培养: 子宫内膜 基质细胞: 培养 2 天在倒置 相差显微镜下可 见细胞呈极性生长, 培养 3～4 天细胞 基本长满瓶底, 仍呈极性生长, 细胞与细 胞间界限不明 显。子宫内膜上皮细 胞: 培养 5 天 细胞呈多角状 生长, 细胞与细胞间界限清楚。复 苏后细胞接种后, 细胞存活 率> 40% , 培养 3～4 天后 两种细 胞基 本长 满瓶底, 细 胞呈融合状, 细胞形态不变。
5. 细胞冷 冻及复 苏: 消 化后 的细 胞用培 养液 洗 2 次, 以 10% 的二甲基亚砜 做保护剂, 细胞浓度为 107 以 上, 4℃20 分钟, 然后移至- 20℃20 分钟, - 80℃过夜, 或直接置入液氮罐中保存, 保存时间为 1 个月以上。细 胞复苏: 从液氮中取 出细胞, 立即 置于 37℃水浴 中 7～ 10 分钟, 不断 摇动 冷冻 管, 用培 养液 洗 2 次即 按 106/
3 Berman A , Edw ards BS , Hal et t JM , et al. Circulat ing and t issu e end ot helin im munoreactivit y in advanced at herosclerosis . N Engl J M ed, 1991, 325: 997.
2 Hirat a Y , T ak agi Y , Fuku da Y , et al. E ndot hel in is a pot ent mit ogen f or rat vascular smoot h mu scl e cell s. A t her os cl ers is, 1989, 78: 225.