亲和色谱的分离技术

亲和色谱的分离技术

摘要本文主要对亲和色谱的相关信息如起源发展、分类、应用、前景等做了介绍。重点介绍了亲和色谱的分类以及不同的亲和色谱的原理特点以及应用。

关键词亲和色谱起源发展；亲和色谱分类；亲和色谱应用；亲和色谱前景

前言亲和色谱在就是把与目的产物具有特特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，可把目的产物从混合物中分离出来。如抗原与抗体，酶蛋白与辅酶。如今，很多研究学者研究不同类型的亲和色谱。冯文科等［1］介绍了三嗪染料配基亲和色谱(包括高效亲和色谱)分离纯化蛋白质的基本原理和方法，并介绍了染料亲和色谱固定相制备方法及应用的最新发展；赵胜利等［2］介绍了固定金属离子亲和色谱(IMAC)吸附蛋白质的基本原理、蛋白质吸附与解吸的影响因素以及洗脱过程中需要注意的问题，并简述了IMAC今后研究的方向；孙维敏［等3］研究抗体纯化中亲和色谱配体的进展；庄海宁［4］研究免疫亲和色谱的原理及其在食品安全检测中的应用；王迪等［5］研究免疫亲和色谱及其在兽药残留检测中的应用；王继华等［6］阐述了免疫亲和色谱技术生化提纯可溶性核糖核蛋白SSA抗原、SSB抗原的特点，同时展望了免疫亲和色谱的发展状况；贾凌云等［8］研究亲和色谱仿生配基在筛选和设计方面的进展；苏成芝等［10］制备了Trypsin Sepharose 4B亲和层析柱，采用硫酸铵、三氯醋酸沉淀、离心色谱、降冻干燥等技术，对猪胰脏中胰蛋白酶抑制剂进行分离纯化，测定各步中的活性；钱俊青［11］等应用前沿亲和色谱研究分子间相互作用及其应用。

本文主要介绍亲和色谱的发展、原理、分类以及各种亲和色谱的特点以及应用，还有其前景发展。

1、亲和色谱的起源和发展

1910年Starkenstein将蔗糖酶抗体吸附到高岭土上研究了抗体和抗原的相互作用并发现淀粉酶与不溶解淀粉键合得十分紧密；

1924年Engelhardt提出固定配偶原理作为分离生物活性物质的方法；

1933年Holmtergh利用淀粉凝胶进行色谱分离从淀粉酶中分离出淀粉酶；

1951年Camptell将抗原白蛋白固定在重氮基对氨基苄基纤维上用以纯化抗体；

1953年Lerman将偶氮染料固定在纤维素上纯化蘑菇中的络氨酸酶；

1954年GrubhoferSchleith为应用目的将羧肽酶淀粉酶胃蛋白酶核糖核酸酶固定在重氮化氨基聚苯乙酰树脂上；

1959年Porath和Flodin将葡萄糖Sephadex基体引入亲和色谱中使亲和色谱得到快速发展；

1963年Merrifield提出固相肽合成方法为亲和色谱固定相制备提供了可借鉴的途径；

1964年Hjerten研制出球形琼脂糖它与葡聚糖都适用作亲和色谱的基体材质；

1967年AxenPorthErnback提出用溴化氰活化琼脂糖的方法为多肽蛋白质在基体上固定化开辟了新的方法；

1968年Cuatrecases和Wilchek定义亲和色谱的概念扩展亲和配位体范围包括酶抗原半抗原抗体激素维生素外援凝集素糖蛋白膜蛋白病毒细胞等确立了生物特效亲和色谱方法；

1970年Cuatrecasces进一步完善溴化氰活化琼脂糖的方法并提出在固相基体和配位体之间插入空间间隔壁的概念和方法成功的解决了配位体的立体可接受性问题对亲和色谱的发展做出了突破贡献；

1972年Yon提出利用在水溶液中非极性官能团之间的接触组合来分离蛋白质和核酸的硫水作用色谱方法Wulff提出了印迹分子色谱法；

1973年Couper提供甲基丙烯酸乙二醇聚酯载体SpheronBrocklehurst提出用2吡啶二硫化物作配位体的共价色谱法Hayman用亲和色谱法分离细胞；

1974年Epton提供聚丙烯酰吗啉载体EnzacrylEasterday提出用三苯甲烷染料作配位体的染料配位色谱方法；

1975年Kristeinsen用亲和色谱法分离病毒；

1977年Porath提出用24二硝基苯作配位体的电荷转移色谱方法；

1978年Porath提出用金属离子螯合物作配位体的定位金属离子亲和色谱方法Ohlson 提出以大孔微粒硅胶作载体的高效液相亲和色谱法；

1980年到1990年CD冠醚穴醚杯芳烃大环抗生素用作亲和包合配位体发展包含了配合物亲和色谱方法Armstrong首先应用包合配合物亲和色谱方法；

1990年到2000年新型载体获广泛应用如灌注色谱固定相Poros无极氧化物ZrO2TiO2CeO2WO3及杂化材料ZrO2脲醛树脂复合微球；

如今，亲和色谱已经广泛应用于生物分子的分离和纯化，是目前分离纯化药物蛋白等生物大分子最重要的方法之一，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等；也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。通过人们不懈的研究，利用亲和层析技术已成功地分离了单克隆抗体、人生长因子、细胞分裂素、激素、血液凝固因子、纤维蛋白溶酶、促红细胞生长素等产品。该技术的最大优点在于：利用它可以从粗提物中经过一些简单的处理便可得到所需的高纯度活性物质，它有效地集合了化工与生物技术，是生物化工的重要发展方向。

2、亲和色谱的原理以及基本过程

2.1 亲和色谱的原理

亲和色谱也称为亲和层析，是色谱分离技术的重要分支，是一种利用固定相的结合特性来吸附目标产物，而达到分离纯化的液相色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连续与待分离的物质有一定结合能力的分子，涉及分子间的范德华力、疏水作用力、静电吸引力、络合作用以及空间位阻效应等作用力因素，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和色谱可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去除或减少混合物中某一分子的含量。亲和色谱分离的通常是混合在溶液中的物质，比如细胞内容物、培养基或血浆等。待分离的分子在通过色谱柱时被固定相或介质上的集团捕获，而溶液中其他的物质可以顺利通过色谱柱。然后把固态的基质取出后洗脱，目标分子即刻被洗脱下来。例如利用酶与基质(或抑制剂)、抗原与抗体，激素与受体、外源凝集素与多糖类及核酸的碱基对等之间的专一的相互作用，使相互作用物质的一方与不溶性担体形成共价结合化合物，用来作为层析用固定相，将另一方从复杂的混合物中选择可逆地截获，达到纯化的目的。

2.2 亲和色谱的基本过程

（1）配基固相化将与纯化对象有专一结合作用的物质连接在水不溶性载体上制成亲和吸附剂后装柱

（2）亲和吸附将含有纯化对象的混合物通过亲和柱纯化对象吸附在柱上其他物质流出色谱柱

（3）解吸附用某种缓冲液或溶液通过亲和柱把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来

如果分离的目的是去除溶液中某种分子那么只要分子能与介质结合即可可以不必进行洗脱

3、亲和色谱的分类

按照分离原理可以分为免疫亲和色谱、金属离子亲和色谱以及拟生物亲和色谱。

3.1 免疫亲和色谱（IAC）

3.1.1 IAC的原理