绿色荧光蛋白(GFP) 的特性及其在分子生物学研究中 的应用

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一 GFP 的结构、特性与功能
1 GFP 的结构
P rasher DC 首 先 克 隆 了 水 母 Jellyfish(A equorea v ictoria GFP)的cDNA[ 6 ],GFP编码的238个氨 基酸的多肽单体，推导分子量Mr=26888，与先前用变性电泳测得的天然 GFP 分子量 （30 KD a ） 接近。根据DNA序列推导的氨基酸序列与大部分天然GFP的多肽片段相同。只有完整的GFP 分子才会 产生生物荧光, 但与荧光的产生直接有关的是GFP 分子中一小段被称为色基(Ch rom opho re ) 的部位 （图2。在GFP的初级氨基酸序列上, 第65～67个氨基酸(Ser¯Tyr¯Gly）¯¯¯¯ 形成环状六肽三体, 以共价形式与GFP蛋白肽键骨架相连 。色基形成的机理目前尚不清楚,但在有分子 氧存在的条件下, 酪氨酸氧化成脱氢酪氨酸, 并环化形成六肽, 这可能是形成色基的必然过程。Sh im om u ra 最先推导了水母GFP色基结构，后来Ward等进行了进一步验证与修改。GFP的cDNA克隆序列分 析表明，在2.6kb范围内至少分布有3个启动子，组成色基的Ser¯Tyr¯Gly三体就位于第二个内含子3’端
体观察到GFP荧光,集中在细胞质或核周围部。紫外光下液 泡显蓝色荧光,蓝光下叶绿体显红色荧光,出现黄色荧光是叶 绿体红色荧光与GFP绿色荧光的重叠效果。HuW也报道,用 电击法和PEG法同时转化玉米和拟南芥菜(Arabidopsis)原生 质体,GFP在玉米原生质体中表达,但PEG介导比电击法转化 效率高,而拟南芥菜原生质体中未观察到GFP表达[33]。不过 Sheen J等利用基因枪(Microprojectile bombardment)轰击 拟南芥菜完整叶片和根组织,观察到活体GFP荧光。Niedz RP等用电击法转化甜橙(Citrus sinensis)原生质体,450~490 nm蓝光下观察到20%~60%原生质体发生较强绿色荧光[34]。 此外,也有GFP在菸草、水稻中表达的报道。GFP在多种原 核和真核生物细胞中表达,表明GFP色基形成的翻译后修饰 过程并非需要原有水母(A.victoria)细胞中任何其它成份或共 因子。亦表明GFP作为报告基因,其表达不受生物类型、基 因型或细胞组织类型的限制,具有广泛的利用前景。
二GFP 在分子生物学研究中的应用
2.1 GFP 作为报告基因用于转基因研究 自Prasher DC从水母(A.victoria)中克隆了GFP的cDNA 后,GFP能在原核和真核细胞中表达的表达载体相继被构建 成功。Chalfie M构建了GFP大肠杆菌表达载体,GFP基因 在T7启动子控制下很容易在大肠杆菌中高效表达。从转染 的大肠杆菌中分离的GFP蛋白与水母的天然GFP离体光谱 特性无差异。利用维管蛋白(β-tubulin)基因mec-7启动子构 建表达载体,转染线虫(Caenorhabditiselegans),在幼虫的4 种胚性起源触觉受体神经元细胞中,观察到很强、很稳定的 GFP荧光,包括部分2龄幼虫、所有4龄幼虫和绝大多数幼小 成虫。据报道,GFP基因在酵母(Saccharomyces cerevisiae)、果蝇(Drosophila melanogaster)以及多种哺 乳动物细胞(中国仓鼠卵巢细胞系、人体胚性肾细胞系、猿 猴Cos-1细胞系以及鼠NIH3T3细胞系等)中表达,都相继成 功[20,29,30,31,32]。GFP在高等植物中的利用较晚,表达 成功的例子还不多。Sheen J等报道,通过电击法 (Electroporation)转染玉米叶肉原生质体,有50%原生质
2.3 GFP融合蛋白用于研究蛋白质定位、移动 及相互作用
异质蛋白可以和GFP的N-端或C-端连接组成融合蛋白。GFP融合蛋白既保留了 异质蛋白的固有特性,也保留了GFP的正常活性。因此,GFP融合蛋白,实际上可 作为一种“荧光标签”用来研究蛋白质在细胞中的定位、转移、相互作用等内 容。Clontech公司构建了6种GFP融合蛋白载体。KaimSR利用GFP融合蛋白载 体研究细菌致病性,即用GFP融合蛋白载体转化沙门氏杆菌 (Salmonellatyphimurium),再侵染人的HEP-2细胞,并用若丹明(rhodaminephalloidin)染色,在荧光显微镜下观察。若细菌只侵染到细胞表面,只在细胞表面 呈现绿色荧光(GFP表达信号);若细菌已侵入细胞内部,则培养细胞呈现黄色荧光, 这是GFP表达的绿色荧55薛启汉:绿色荧光蛋白(GFP)的特性及其在分子生物学 研究中的应用光与细胞若丹明染色的红色荧光的重叠效果。因此,利用GFP融合 蛋白为“荧光标签”,可以直接活体观察到细菌蛋白和报告蛋白在细胞中的确切 位置,以表明细菌在活体细胞中的侵染状况。同样原理,Youvan构建了菸草花叶 病毒和GFP的融合蛋白载体TWV-GFP。Banlcombe DC构建了马铃薯X病毒和 GFP的融合蛋白载体PVX-GFP[41]接种菸草(N.clevelandii)1~2天后,在紫外光 下可以直接观察到病毒侵染的确切部位。再用首次感染的菸草汁液接种另一种 菸草(N.benthamiana),观察到已放大的第二次系统感染的绿色荧光斑点。叶片 提取液蛋白电泳凝胶在紫外光下也能见到GFP荧光信号,从感染叶片中回收的病 毒经鉴定,确认为PVX-GFP。构建载体时,直接用GFP基因替代病毒外壳蛋白基 因,接种后观察到GFP绿色荧光只局限于接种的细胞部位,不扩散。证实了早先 的论断,即PVX外壳蛋白对于病毒在寄主细胞内的增殖,以及在细胞间的移动、 扩展是不可缺少的条件[42,43,44,45,46,47]。显然,GFP融合蛋白作为一种报告 标记,可以为病毒学研究,或以病毒载体为途径研究外源基因在转基因生物细胞 中的表达及蛋白质定位,提供理想的工具[48,49,50]。与传统的荧光抗体相 比,GFP不仅灵敏度高,不需要反应底物,还可以消除因抗体与非靶位点结合带来 的背景荧光的干扰。
绿色荧光蛋白(GFP) 的特性及 其在分子生物学研究中 的应用
生物发光现象, 在无脊椎动物中很普遍。它是生物能量的一种转换方式 [ 1, 2 ]。在水母(Jellyfish) 中, 当能量从 Ca + + 活化的水母蛋白(A equo rin ) 转移到绿色荧光蛋白(Green F luo rescen t P ro tein, 简称GFP)上以 后，它即发出绿色荧光。活体GFP与纯化的 GFP 具有相同光谱特性, 即吸收蓝光, 放射绿光。可以用紫外灯、荧光显微镜或荧光活化流体分 光光度计进行活体检测 。由于GFP 稳定、灵敏度高、无生物毒性、荧 光反应不需要任何外源反应底物及表达无物种或细胞组织的专一性, 因 此它是一种独特的 报告蛋白(R epo rter p ro tein) , 可广泛用于基因的表 达与调控、蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化, 以及细胞的分离与纯化等研究领域。90年代后, 有关GFP 及其利用的研 究进展较快，已引起分子生物学家极大的兴趣与关注。
2 GFP 的光谱特性
GFP吸收的光谱, 最大峰值为395nm(紫外)，并有一个峰值为470nm的副峰（蓝 光）；发射光谱最大峰值为509nm(绿光），并带有峰值为540nm的侧峰 （Shouder).GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素 FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察。尽管450~490 nm(蓝 光)是GFP的副吸收峰,但由于长波能量低,细胞忍受能力强,因此更适合于活体检 测。Chroma技术公司(Chroma Technology Corp.Brattlebore,VT 05301,USA)已 研制出一系列适合于GFP观察的滤光片组合。利用重组突变[10,11,12]和数字联 想分光显微镜( Digital ImagingSpectroscopy)技术[13,14,15]可以诱发GFP色基 突变,改变GFP光谱特性。Heim R等[16,17]获得了野生型GFP的一系列随机突变, 其激发波长和发射波长都发生了变化(表1)。如获得的蓝色荧光突变,就是原GFP 分子中第66个氨基酸由酪氨酸突变成的组氨酸,但荧光信号减弱了近50%。 Delagrave S获得的红色漂移(Red-shifed)突变,与野生型GFP相比,其激发波长向 红色方向漂移了近100 nm[18]。具有不同光谱特性的GFP突变体的获得,使在同 一细胞中同时分析两种不同蛋白或启动子成为可能,可以用于发育细胞学、药物 筛选、分析诊断等研究。
2.2 GFP作为报告蛋白用于基因表达的调 控效果研究
Clontech公司构建了一种叫启动子报告载体(Promoter reporter vector)即 没有启动子的GFP质粒,专门用来测试各种启动子对GFP表达的效率,以 及某些增强子对GFP表达的调控效果。发现用玉米C4PPDK基因5′端的 非翻译片段(5′VTR)与花椰菜花叶病毒的35S启动子连接,GFP在玉米原生 质体中的表达效率比对照质粒(只有35S启动子)提高近15倍,因为5′VTR 片段中含转录增强子。用拟南芥菜热体克(Heat-shock)基因启动子构建 GFP表达载体,用以转化玉米原生质体。发现42℃热激处理中50%原生质 体表达GFP荧光;37℃处理的荧光较弱;而常温下培养,则完全观察不到原 生质体中的GFP荧光。在高等植物遗传转化的基因表达调控研究中,已有 很多报告蛋白被应用,包括Lac Z (β-galactosidase )[35]、CAT ( Chloramphenicolacethytransferase)[36]、Luc(荧光虫 Luciferase)[37,38]和GUS(β-glucuronidase)[39]等。但这些报告蛋白都 是酶,其表达产物的检测都需要进行细胞固定、组织切片或蛋白提取等破 坏性处理,很难用于活体观察和检测。GFP作为一种活体报告蛋白[40],用 于研究基因表达的调控,明显具有其它报告蛋白不可替代的优点
3 GFP的稳定性
GFP荧光极其稳定,在荧光显微镜强光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素 (fluorescein)强[19]。特别在450~490 nm蓝光波长下更稳定,但在340~390 nm或395~440 nm范围内,仍会发生光漂白现象。GFP在不同物种中稳定性不同,在果蝇和斑纹鱼(Zebra fish)中极稳定;在大肠杆菌中会有光漂白;在线虫中10 mM的NaN3将加速光漂白。GFP需要 在氧化状态下产生荧光,强还原剂如5 mM Na2S2O4或2 mM FeSO4能使GFP转变为非荧 光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂,如2% 巯基乙醇、10 mM DDT、10 mM还原谷胱甘肽、10 mM半胱氨酸等并不影响GFP荧光。 中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等,但GFP对 某些封片指甲油特别敏感,苯氧丙烷对GFP荧光也有影响。强氧化剂如1% H2O2,或硫氢基 试剂如1 mM DTNB会造成GFP不可逆性破坏[20]。大多数中等浓度的有机试剂不减弱GFP 荧光,但其最大吸收峰值会改变[21]。在高蛋白、高盐条件下,GFP通过疏水反应形成二聚体, 使470 nm吸收峰值下降近4倍。GFP很容易从细胞中分离并结晶[22]。在离体状态下,GFP 蛋白对热(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通蛋白酶(链霉蛋白酶Pronase 除外)有较强抗性[23]。GFP荧光在pH值为7~12时稳定,在pH值为5.5~7.0时开始受影响[24]。 在纳克级水平,SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶中仍能观察到GFP荧光。在高温、极端pH、或胍 基氯化物条件下,GFP会变性,荧光消失。一旦复性,荧光会部分恢复[25],但可能需要某些硫 醇类化合物的作用[26]。GFP在各种生物活体条件下表现稳定。例如氯霉素乙酰转移酶 (CAT)在生物体内很稳定,用35S-甲硫氨酸分别标记CAT和GFP,并转染玉米叶肉原生质体, 用放线菌酮处理原生质体,通过CAT检测,发现5~10µg/ml放线菌酮可完全抑制CAT在玉米原 生质体中的蛋白合成,但通过GFP观察,转染24小时后,仍未发现GFP荧光有明显减弱,仅有部 分GFP被放线菌酮降解。说明GFP在植物活体细胞中比CAT还要稳定[27]。此外,尽管GFP 的消光系数较低,但和荧光素一样,额定含量可高达80%。在荧光显微镜下,GFP融合蛋白的 荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。 但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋 白。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP 是迄今为止唯一一种活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。