原位杂交实验

一实验主要试剂、溶液和仪器

耐高温器皿180℃烘烤8 h以上，其它器皿用氯仿冲洗，溶液用0.1%焦碳酸二乙脂(DEPC)处理或DEPC-H2O (DEPC处理过的蒸馏水)配制。

①主要试剂

Anti-Digoxigenin-AP 生产商：Roche 货号：11093274

nuclear fast red solution 生产商：sigma 货号：N3020

BCIP/NBT Liquid Substrate System 生产商：sigma 货号：B1911

Proteinase K 生产商：promega 货号：V3021

ISH buffer 生产商：Exiqon

其它试剂：

浓盐酸、去离子甲酰胺、Tween-20等

②主要溶液

DEPC-H2O、DEPC-PBS、20XSSC、TBST、预处理溶液、杂交液、封闭液

●DEPC-PBS：DEPC处理的PBS，高温高压灭活。

●20XSSC（100ml）：NaCl 17.53g、柠檬酸钠 8.82g，NaOH调pH为7.0（DEPC处理），高温高压灭活。

●TBST：0.1M Tris pH7.5，0.15MNaCl，0.1%Tween-20

●封闭液：5%正常山羊血清和1%BSA溶液

③仪器

显微镜生产商：Olympus型号：BX51

拍照系统生产商：Olympus型号：DP71

二原位杂交实验方法

1.脱蜡和水化：二甲苯2次，每次10分钟；依次经100%、95%、80%、75%乙醇和DEPC- H2O各一次，每次

5分钟。

2.0.2N HCl室温处理5分钟。

3.PBS洗3次，每次5分钟。

4.蛋白酶K（40μg/ml）室温孵育20分钟。

5.含0.2%甘氨酸的PBS洗3次，每次5分钟。

6.4%多聚甲醛固定10分钟。

7.PBS洗2次，每次5分钟。

8.预处理溶液室温孵育10分钟。

9.PBS洗2次，每次5分钟；

10.加入ISH buffer，56℃预杂交2小时。

11.甩去预杂交液，每样本加入50μl杂交液，56℃杂交过夜。

12.5XSSC洗2次，每次20分钟。

13.50%去离子甲酰胺/2XSSC 50℃洗3次，每次20分钟。

14.TBST洗5次，每次5分钟。

15.室温封闭1小时。

16.加anti-Digoxigenin-AP工作液（1：500）4℃孵育过夜。

17.TBST洗4次，10分钟。

18.BCIP/NBT染色液缓冲液洗2次，每次10分钟。

19.BCIP/NBT染色液暗处染色4~24小时。

20.TE（pH8.0）buffer终止反应.

21.nuclear fast red solution复染

22.水洗残液，50%，75%，85%，95%和100%乙醇梯度脱水各1次，二甲苯透明2次，每次5分钟。

23.中性树胶封片。