原位杂交实验操作步骤

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原位杂交技术的操作详解及小贴士

原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术是一种基因组分析方法，用于确定一些特定DNA序列在细胞或组织中的位置。

该技术可以帮助研究人员了解基因组的结构和功能，以及基因在不同细胞类型中的表达模式。

下面将详细介绍原位杂交技术的操作步骤及一些建议。

操作步骤：1.准备DNA探针：首先需要选择合适的DNA探针，用于与目标DNA序列杂交。

DNA探针可以是标记有荧光分子或放射性同位素的DNA序列，用于在杂交后的图像检测或放射计数。

2.制备标本：从目标细胞或组织中提取DNA，并进行适当的处理步骤以便于杂交反应。

其中的处理步骤包括固定、裂解、脱氧核酸酶处理等。

3.杂交反应：在杂交缓冲液中，加入DNA探针和标本DNA，并进行杂交反应。

杂交条件（包括温度、时间和盐浓度等）会根据探针和目标序列的碱基配对特性进行选择。

对于不同的实验目的，例如检测靶基因在组织中的表达模式，杂交条件需要根据实验要求确定。

4.洗涤：在杂交反应结束后，需要进行洗涤步骤以去除非特异杂交的DNA。

通过在高温、高盐浓度或低温条件下进行洗涤，可以选择性地去除未与目标DNA序列配对的DNA。

5.可视化和成像：根据DNA探针的标记方式，采用不同的方法进行可视化和成像。

对于荧光标记的探针，可以使用荧光显微镜观察，并通过分析图像来确定特定DNA序列的位置。

对于放射性标记的探针，可以使用辐射自显像片、液闪仪或放射计数仪等设备进行检测和计数。

小贴士：1.选择合适的探针：为了获得准确的结果，选择合适的探针非常重要。

探针的特异性和亲和力会直接影响到杂交的特异性和效率。

因此，在设计和合成探针时，需要考虑目标DNA序列的长度、特异性和亲和力等因素。

2.优化杂交条件：杂交条件的优化对于获得准确的结果非常重要。

温度、盐浓度和杂交时间是影响杂交反应的重要因素。

通过调整这些条件，可以增强目标DNA和探针的碱基配对能力，提高杂交特异性和效率。

3.正确选择洗涤条件：洗涤步骤的正确选择可以帮助去除非特异杂交的DNA。

原位杂交操作流程

原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1)二甲苯于37°C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4)PBS清洗3分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗10分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37°C孵育15分钟；8)PBS清洗2次，每次3分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次3分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12)PBS清洗2次，每次5分钟；13)预杂交缓冲液孵育30分钟；14)准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85°C加热5分钟，置于冰块中10分钟；15)杂交；第二天16)将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17)PBS清洗3分钟；18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中)，37°C孵育30分钟；19)PBS清洗5分钟；20)室温，2XSSC清洗10分钟；21)37°C，1XSSC清洗10分钟；22)37°C，0.5XSSC清洗10分钟；23)缓冲液A孵育10分钟；24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟；25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim)，37°C孵育3小时；26)缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27)缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时;29)停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30)固红，脱水以及封片进行核的复染。

2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1)二甲苯于37C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4)PBS清洗5分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗5分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml，37C孵育10分钟；8)PBS清洗2次，每次5分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次5分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2XSSC清洗10分钟；18）37°C,1XSSC清洗10分钟；19）37°C,0.5XSSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37C孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。

原位杂交技术的具体步骤

原位杂交（In situ hybridization）是一种用于检测核酸序列在细胞或组织中的位置和表
达水平的技术。

下面是原位杂交技术的一般步骤：
1.样品固定：首先，准备需要检测的细胞或组织样品，并将其进行固定。

常用的固定方法包括使用乙醛、乙酸、甲醛等。

2.使DNA或RNA标记：选择适当的探针，它可以是DNA或RNA序列，用于与目标
核酸序列杂交。

标记的方法通常使用荧光染料、酶或同位素等。

3.制备与标记探针配对的杂交缓冲溶液：制备含有探针的杂交缓冲溶液，其中包含适当的盐和添加剂，以提供最佳的杂交条件。

4.杂交：将标记的探针加入样品中，让其与目标序列进行杂交。

这一步可以在高温条件下进行，以增加探针与目标序列的特异性结合。

5.洗涤：进行一系列洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异结合物，提高信号的特异性。

6.反应可视化：根据所使用的标记方式，进行合适的染色或检测步骤，以显示杂交信号。

这可以是荧光显微镜观察、酶反应染色或同位素探测等。

7.结果分析：通过显微镜观察或其他适当的图像分析方法来解读和分析杂交结果。

评估信号的位置、强度和特异性。

这些步骤仅为一般原位杂交的基本流程，具体的实验条件和步骤可能会根据研究目的
和样本类型的不同而有所调整。

原位杂交技术在生物医学研究等领域广泛应用，可以
帮助研究者了解基因表达和变化的空间定位和时序关系。

分子生物学实验中的原位杂交技术使用方法介绍

分子生物学实验中的原位杂交技术使用方法介绍分子生物学是一门研究生物分子结构、功能和相互作用的科学。

原位杂交技术是其中一种常用的实验方法，用于研究DNA或RNA在细胞或组织中的位置和表达情况。

本文将介绍原位杂交技术的使用方法，包括样品准备、探针设计、杂交条件和信号检测等方面。

一、样品准备在进行原位杂交实验前，首先需要准备样品。

样品可以是细胞、组织或整个生物体。

对于细胞和组织样品，需要进行固定和切片处理。

固定可以使用甲醛或乙醛等化学试剂，切片则需要使用显微刀或切片机。

对于整个生物体样品，需要进行组织切片或冰冻切片处理。

二、探针设计探针是原位杂交实验中的重要部分，用于与目标DNA或RNA序列特异性结合。

探针可以是DNA或RNA，通常标记有荧光染料或放射性同位素。

在设计探针时，需要考虑目标序列的长度、GC含量、互补性和特异性等因素。

同时，还需要选择适当的标记方法和标记物，以便在实验中检测到探针的信号。

三、杂交条件杂交条件是决定原位杂交实验结果的关键因素之一。

杂交温度、盐浓度和杂交时间等参数需要根据目标序列的特性进行优化。

通常情况下，较高的杂交温度和适当的盐浓度有助于提高探针与目标序列的互补性结合。

杂交时间一般在数小时到数天之间，具体根据实验需要进行调整。

四、信号检测信号检测是原位杂交实验中的最后一步，用于观察和记录探针与目标序列的结合情况。

常用的信号检测方法包括荧光显微镜观察、放射性计数和原位杂交染色等。

荧光显微镜观察是最常见的信号检测方法，可以通过荧光染料的发射和目标序列的位置来确定探针的结合情况。

放射性计数则是使用放射性同位素标记的探针进行测量，通过探针的放射性衰减来判断探针与目标序列的结合情况。

原位杂交染色是一种较为传统的信号检测方法，通过染色剂与探针结合来观察目标序列的位置和表达情况。

原位杂交技术在分子生物学研究中具有广泛的应用。

它可以用于研究基因表达、基因定位、基因组结构和染色体变异等方面。

通过合理设计实验方案和优化实验条件，原位杂交技术可以提供有关生物分子在细胞和组织中的空间分布和功能调控的重要信息。

原位杂交步骤-自己整理的1

原位杂交步骤-⾃⼰整理的1荧光原位杂交试剂及其配制⽅法（以下试剂均需⽤RNase-free⽔配制）：1×PBS：NaCl 8g⁄L、KCl 0.2 g⁄L、Na2HPO4 1.44 g⁄L、KH2PO4 0.24 g⁄L，溶于DEPC处理的去离⼦⽔中，⽤pH 计测其pH，再⽤NaOH调其pH为7.4；PBST：PBS加0.1%吐温-20；LiCI：配4M LiCI 100ml需要LiCI．H20 25.6g，配好后加⼊千分之⼀的DEPC，37℃，12h放置，⾼温灭菌。

4%多聚甲醛（4%PFA）：准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r⁄m）上，待其全部溶解后，⽤棕⾊瓶分装成⼩体积包装，保存于－20℃。

（注：本⽅法与其他⼀些⽂献⽤NaOH和HCl先后调节pH⽽促其溶解的⽅法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采⽤上述⽅法使多聚甲醛缓慢溶解⽽没有采⽤⽂献中提及的⽤NaOH调节其pH⾄10促其溶解后再⽤HCl调节pH的原因，除了⽤⼀般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，也因为不能⽤pH计对其酸碱度进⾏测量，因为它会损坏pH 计）。

取以上各成分，溶于DEPC处理过⼀定量的纯⽔（或双蒸⽔）中，测定其pH(放置⼀段时间待其pH稳定后)，据此以HCl或NaOH来调节其pH值⾄7.4，定容⾄所要求的体积。

（注：根据实际情况，因DEPC处理过的⽔其pH会下降，故本实验中实际上是⽤1mol⁄L的NaOH来调节其pH）。

75%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按75%（V／V）⽐例溶于PBST；50%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按50%（V／V）⽐例溶于PBST；25%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按25%（V／V）⽐例溶于PBST；HYB－溶液：50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、0.1%吐温-20（终浓度）、RNase-free⽔（－20℃）pH6.2HYB＋溶液：HYB－溶液、500ug／ml酵母tRNA、50ug／ml（终浓度）肝素，（－20℃）；pH6.250%甲酰胺／2×SSCT：50%甲酰胺（V／V），2×SSCT（终浓度）；2×SSCT：2×SSCT（终浓度），0.1%吐温-20；MAB马来酸缓冲液（Maleic acid buffer）：100mM maleic acid，150mM NaCl，pH 7.5(20℃)，溶于双蒸⽔，⽤浓缩或固体的NaOH调节pH 为7.5，并过滤除菌（sterile）MABT:MAB，使⽤前加⼊0.1%吐温-20；10×Blocking reagent（阻断剂）：将阻断试剂（Blocking reagent）溶于马来酸缓冲液中，摇晃并在加热器或微波炉上加热，使其终浓度为10％（w/v）；此储存液（原液）需⾼温除菌？（is autoclaved）并分装后保存于－20℃。

荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明

荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中的位置的技术。

下面将详细介绍荧光原位杂交的具体步骤和相应的详细说明。

1.细胞准备首先，需要准备细胞样本。

可以选择使用原代细胞，细胞悬液或切片等。

2.固定将细胞固定在载玻片或载玻片上面。

固定通常使用的试剂是乙酸乙酯和甲醇的混合物，通常比例为1:33.水合将载玻片中的组织或细胞水合处理。

这一步可以通过将载玻片浸泡在去离子水或缓冲液中进行。

4.处理将载玻片进行预处理，以使DNA或RNA序列更易于杂交。

常用的预处理方法有：-煮沸：将载玻片浸泡在2×SSC（1×SSC：0.15MNaCl,0.015MNa3C6H5O7·2H2O,pH7.0）中，然后置于热盖板上加热至100°C，持续约10-20分钟。

-碱性水解：将载玻片浸泡在10%NaOH中，进行碱性水解，然后在盐溶液中冲洗。

5.杂交探针准备荧光探针或荧光标记的引物。

探针的选择取决于要检测的DNA或RNA序列。

探针的设计通常基于目标序列的序列信息，并且通过化学修饰和荧光标记以增加其杂交效率和检测灵敏度。

6.杂交将探针加到载玻片上的样本上，并与目标序列进行杂交。

杂交过程中，探针与目标序列进行互补配对，形成探针-目标复合物。

杂交的温度取决于探针的碱基组成和目标序列的GC含量。

7.洗涤将载玻片在洗涤缓冲液中进行洗涤，以去除未与目标序列杂交的探针。

8.检测使用荧光显微镜观察载玻片上的标记。

荧光标记的探针将通过荧光显微镜检测获得荧光信号。

根据荧光信号的数量和强度，可以确定目标序列的位置和数量。

9.成像和分析通过拍摄荧光显微镜图像来记录荧光信号。

使用图像处理软件进行图像分析，包括亮度分析和定量信号分析。

总结：荧光原位杂交是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中位置的强大技术。

原位杂交实验操作步骤

原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。

现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。

二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。

过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。

两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。

用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。

DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。

下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。

三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。

（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。

一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。

这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。

（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。

以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。

铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。

原位杂交

原位杂交原位准备工作：1、不锈钢与玻璃器皿180度烘12小时以上2、需DEPC处理的三蒸水约8升（听说可以用灭菌三蒸水代替）3、双蒸水可以用一馏水（即蒸馏水）代替4、所用枪头可以灭一个小时烘干用（也可用烘好的移液管）5、所用蜡片温度不能过高，防止材料变形6、切片一定要尽量吸干，并且烘12小时以上（但不能过长），以防脱落7、实验所需试剂的量要略作变动，大缸约600ml，小缸约500ml8、所有试剂除储备液外，最好都现配现用，请备好足够的烘好的量筒及容器最后强调杂交之前配试剂、融蜡与加蜡所用一切器皿器具都要180度处理，请戴乳胶手套（尽量避免接触其它地方）以防组织RNA降解下次做需买的东西：1、t RNA（一个100u的加50ul水，较粘稠吸取时应慢些，并看一下是否吸到）2、BSA（一次约需15克）3、多聚甲醛（一次约需20克）4、非去离子甲酰胺（一次约需200多ml）5、RNAse（实验室可能有）6、最好领2个2L的三角瓶7、乳胶手套8、无水乙醇（一次约需12瓶，有些地方应该可以95%的代替）做之前请认真检查所需一切用品是否到位I．组织固定和包埋在本实验室条件下推荐使用FAA（50% ethanol, 5% acetic acid, 3.7% 甲醛）固定材料，似乎比4%多聚甲醛固定时抽气更彻底。

FAA固定液（400ml），室温保存：无水乙醇 200ml冰醋酸 20ml37%甲醛 40ml水（DEPC） 140ml1L水加1mlDEPC，37℃过夜（最好一直慢摇或剧烈摇晃后再放入），灭菌第一天：组织固定（下午4、5点取材）将装有2/3体积固定液的青霉素小瓶（小瓶预先在180℃烘过）置于冰上，取新鲜材料投入，冰上真空抽气。

缓慢抽气冒气泡后保持真空15分钟后缓慢放气，如此数次至材料沉底即可，以达到快速彻底固定。

换新鲜固定液，4℃过夜（12～16小时）。

（用DEPC-H2O配酒精）第二天：脱水以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇。

rna样品原位杂交流程

rna样品原位杂交流程RNA样品原位杂交是一种用于分析RNA分子在组织或细胞中位置和表达水平的实验技术。

该技术的应用广泛，可以帮助科学家们了解基因表达模式、发现新的基因调控机制以及研究疾病的发生机制。

本文将详细介绍RNA样品原位杂交的流程，并一步一步回答相关问题。

第一步：样品准备在进行RNA样品原位杂交实验之前，首先需要准备好所需的样品。

这通常包括组织切片或细胞培养物。

对于组织切片，可以通过组织切片仪将组织切割成适当的薄片。

对于细胞培养物，可以通过离心将细胞从培养容器中收集起来。

问题1：为什么需要准备样品？样品的准备是RNA样品原位杂交实验的基础。

只有准备好的样品才能正常进行后续的实验步骤。

第二步：固定样品在进行RNA样品原位杂交实验之前，需要使用适当的方法将样品固定。

常用的固定方法包括使用乙醛、甲醛或细胞固定试剂等。

固定样品的目的是保持样品的形态结构，并防止RNA分子的降解。

问题2：为什么需要固定样品？固定样品可以使细胞或组织的结构保持完整，同时保护RNA分子不被降解。

第三步：蛋白酶消化固定的样品往往含有多种蛋白质，这些蛋白质会干扰RNA杂交的过程。

因此，在进行RNA杂交实验之前，需要使用蛋白酶消化来去除细胞或组织中的蛋白质。

常用的蛋白酶包括蛋白酶K和胰蛋白酶。

问题3：为什么需要进行蛋白酶消化？蛋白酶消化可以降低蛋白质的干扰，提高RNA杂交的灵敏度。

第四步：RNA杂交反应在固定样品的基础上，进行RNA杂交反应是RNA样品原位杂交实验的核心步骤。

在这一步骤中，首先需要制备适当的RNA探针。

RNA探针是用于杂交的RNA分子，通常使用具有标记的RNA分子，如荧光标记的RNA 或酶标记的RNA。

问题4：什么是RNA探针？有什么作用？RNA探针是用于杂交的RNA分子，可以通过与RNA样品发生互补配对来检测RNA的位置和表达水平。

制备好的RNA探针会与待测RNA样本杂交，形成稳定的双链结构。

杂交反应可以在一定的温度和时间条件下进行。

荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤

荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。

其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量。

试验方法如下：1）玻片处理（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。

（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。

（c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。

（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37℃、2h，室温过夜)，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃过夜。

称量试剂勺也要干烤。

塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。

若为进口已处理的无RNase和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。

（e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1mL/L DEPC水配制。

2）样品制备及其所涉及的试剂包括：（a）缓冲溶液1×PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，溶入1000mL超纯水；3×PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，溶入1000mL超纯水；通常配制成10×PBS的储备液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。

荧光原位杂交操作步骤

荧光原位杂交操作步骤荧光原位杂交听起来很复杂呢，其实操作步骤也有章可循啦。

一、样本准备。

要做这个实验，先得把样本处理好。

如果是细胞样本的话，就得把细胞乖乖地固定在载玻片上，就像把小娃娃放在小床上一样安稳。

这一步可不能马虎，固定不好后面就不好办啦。

要是组织样本呢，得把组织切成薄片，薄到像纸片一样精致才行。

然后同样把它固定好，这就为后面的杂交打下了好基础。

二、探针准备。

接下来就是探针啦。

探针就像是专门去找目标的小侦探。

得按照实验要求把探针配好，浓度要刚刚好哦，太浓了可能会乱了阵脚，太稀了又可能找不到目标。

把探针在合适的缓冲液里调配好，就像给小侦探准备好装备一样。

三、杂交反应。

然后就到了杂交这一步啦。

把准备好的探针滴到有样本的载玻片上，再盖上盖玻片。

这时候就像把小侦探放到了有目标的地方，让它们去寻找匹配的东西。

然后把载玻片放到一个合适温度的环境里，这个温度很关键呢，就像给小侦探们创造一个舒适的工作环境。

在这个环境里让探针和样本中的目标DNA或者RNA去结合，这个过程需要一点时间，就像小侦探寻找目标也不能太着急呀。

四、洗涤。

杂交完了之后呢，就要把那些没有结合的多余探针洗掉。

这就像是把那些凑热闹的家伙赶走，只留下真正找到目标的小侦探。

用合适的洗涤液轻轻地洗，可不能太粗暴，不然把已经结合好的也冲走了就糟糕啦。

五、检测。

最后就是检测啦。

这时候要用专门的荧光显微镜去看。

打开显微镜，就像打开一个神秘的宝藏盒子。

如果杂交成功了，就能看到漂亮的荧光信号啦，就像在黑暗中看到了闪闪发光的小星星。

那些荧光信号所在的地方就是探针找到目标的地方呢。

荧光原位杂交虽然有点复杂，但是按照这些步骤一步一步来，就像照顾小宠物一样细心，也能顺利完成这个有趣的实验啦。

原位杂交实验流程

原位杂交实验流程
原位杂交实验是一种将核酸探针与细胞或组织切片上的DNA或RNA进行杂交，从而对特定核酸进行定位和定量分析的方法。

以下是原位杂交实验的一般流程：
1. 样品制备：获得待检测的样品，可以是细胞、组织、细胞核或染色体等。

样品需要进行处理，包括固定、脱水和烘干等步骤，以便于后续的处理。

2. 探针制备：探针是一段具有特定序列的DNA或RNA，用于检测样品中的特定序列。

可以通过化学合成或PCR扩增等方法制备探针。

探针需要标记一定的标记物，如荧光素或辐射性核素等，以便于检测。

3. 杂交反应：将制备好的探针与处理好的样品进行杂交反应。

反应条件包括温度、盐浓度、pH值等，需要根据探针和样品的特性进行调整。

杂交后，探针会与样品中的特定DNA序列结合，并形成探针-目标DNA复合物。

4. 洗涤：杂交后，需要用洗涤液将未结合的探针洗去，以减少背景信号。

洗涤条件需要根据探针和样品的特性进行选择。

5. 检测：在洗涤后，通过特定的检测方法对探针-目标DNA复合物进行检测。

常用的检测方法包括荧光显微镜观察、放射自显影、免疫组织化学染色等。

6. 结果分析：根据检测结果，对杂交信号进行分析和解释。

通常需要比较杂交信号与已知标准品的信号，以确定样品中是否存在目标核酸序列。

7. 实验重复：为了确保结果的可靠性和准确性，通常需要进行重复实验，并对不同实验条件下的结果进行比较和分析。

总之，原位杂交实验需要精心设计和严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可靠性。

原位杂交实验步骤

(一)原位杂交1、溶液配置：（1）Hybridization buffer（20ml）：Formamide 10ml；20x SSC 5ml；Denhand’s2ml；100mg/ml yeast tRNA 50μL；10mg/ml salmon sperm DNA 1ml；Blocking regent 0.4g；DEPC-water 1.95ml。

（2）The acetylation solution（600ml）：triethanolumine 8ml；Conc. HCl 1050μL；DEPC-water 590ml。

（3）PK ：DEPC-PBS 75ml；PK stock(10mg/ml) 37.5μL。

（4）Denaturizing hybridization buffer（20ml）：hybridization buffer 18.25ml；20%CHAPS 250μL；DEPC-water 1480μL；Tween-20 20μL。

（5）溶液B1（1L）：1M tris PH7.5 100ml；5M NaCl 30ml；Sterile water 1L。

（6）溶液B3（1L）：1M tris PH9.5 100ml；5M NaCl 20ml；1M MgCl 50ml；Water up to 1L。

（7）Blocking solution（20ml）：B1 buffer 18ml；FCS 2ml；10%Tween 100μL。

（8）Developer solution（1ml）：B3 buffer 953μL；NBT(17mg/ml) 20μL；BCIP(8mg/ml) 21μL；Levamisol 5μL；Tween 0.5μL。

2、实验步骤（1）石蜡玻片置于二甲苯中浸泡5分钟，两次，室温。

（2）无水乙醇，95%乙醇，75%乙醇和PBS分别浸泡3分钟，室温。

（3）DEPC-PBS浸泡3min×3，室温并准备the acetylation solution。

荧光原位杂交(FISH)实验步骤

FISH（原位杂交）SOP流程------探针直接带荧光标记一、FISH实验步骤1、石蜡切片脱蜡至水：将挑选好的组织切片置于切片架上放入烘箱中65℃烤片2-3h（观察组织周围石蜡是否被熔化流至切片边缘），烤片完成后将组织切片放入脱蜡机中脱蜡。

脱蜡完成后取出切片，进行抗原修复。

2、抗原修复：脱蜡完成后取出切片，进行酶修复。

稍甩净切片上水分，水平放置在孵育盒，用组化笔在组织周围画圈（过程中组织不能干片，组化笔不能碰到组织，否则会损坏组织或使抗体无法孵育到组织；不可用力按压组化笔以免笔内液体流出覆盖组织），蛋白酶K（PK）37度孵育15-20min，修复完后用PBS冲洗，再将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、固定：甩去残留在片子上的PBS，滴加4%多聚甲醛，室温孵育5min。

用PBS冲洗。

再将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、预杂交：滴加Hyb buffer（预杂交液）55度避光预杂交2小时。

5、准备探针：将探针原液与Hyb buffer按比例稀释，混合均匀后85℃变性3min,37℃平衡2min。

6、杂交：预杂交结束后，吸去Hyb buffer，滴加平衡后的杂交工作液，切片平放于湿盒内，37-42°C（杂交温度依据探针TM值确定）孵育过夜（湿盒内加少量水防止杂交液蒸发）。

7、洗涤：用1XSSC冲洗，浸泡2min。

（洗涤时间不宜过长，可能会洗掉表达）。

8、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育20min。

9、封片：PBS冲掉DAPI，切片稍甩干后用WGA封片剂封片（封片时应避免组织上出现气泡）。

10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。

（蓝光紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）二、荧光结果判读DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光。

荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明

荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。

由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。

1. 探针变性将探针在75℃恒温水浴中温育5 min，立即置0℃，5～10 min，使双链DNA探针变性。

2. 标本变性（1）将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3 h。

（经Giemsa 染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。

（2）取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70% 甲酰胺/2x SSC的变性液中变性2～3 min。

（3）立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5 min，然后空气干燥。

3. 杂交将已变性或预退火的DNA探针10 uL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18x18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17 h）。

由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。

4. 洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。

（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。

（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2xSSC中洗涤3次，每次5 min。

（3）在已预热42～50℃的1xSSC中洗涤3次，每次5 min。

（4）在室温下，将玻片标本于2xSSC中轻洗一下。

（5）取出玻片，自然干燥。

（6）取200 uL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

5. 杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）（1）在玻片的杂交部位加150 uL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。

基因组原位杂交实验程序（双色）

双色原位杂交程序小样法CT AB法提取植物DNA1.将样品幼嫩叶片放在研钵中，加入800μl2%CTAB充分研磨，转入1.5ml离心管中，2. 65℃水浴1h（每20min反转摇匀一次）；60-65℃水浴30-40分钟都可。

3. 加等体积的氯仿－异戊醇（体积比24：1），或加入苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀；4. 12000rpm离心15min，取上清于新管中；5. 重复4，5步骤；（可略去）6. 向上清中加入2倍体积的无水乙醇（或2/3体积的异丙醇）沉淀DNA，-20℃放置20min 或更长时间，或过夜；7.排出絮状DNA or 离心去上清。

8. 加75％的乙醇or76%+NH4AC（10mmol/L）清洗DNA，洗3次，去上清；干燥过夜。

9. 风干后加入100-300ul的1：100的RNA酶：水的混合液或ddH2O溶解DNA；10. 取2ul溶液电泳检测。

探针标记50ng/μl①1×DNA polymerase Ⅰbuffer（1×） 5 μl②dNTP（10μM） 5 μl③Bio-11-dUTP or Dig-11-dUTP（1mM） 1.2 μl④DNase Ⅰ (0.005U/μl) 1μl⑤DNA polymerase Ⅰ (coli.10U/μ) 1.2μl⑥DNA（2.5μg）Xμl⑦ddH2O 36.6-Xμl⑧Total 50μl混匀后置于原位PCR15℃4h，然后利用1％的琼脂糖凝胶检测片段大小，在100－500bp 左右表示酶切完全。

封阻基因组DNA在沸水中处理10-30min, 然后用1％的琼脂糖凝胶检测片段大小，在100－500bp即可作封阻。

原位杂交制片1．酶解用玻片的准备将新的玻片放到80％浓硫酸配制的铬酸溶液（24g三氧化铬溶于200ml水，加浓硫酸至1000ml冰上操作）中室温下至少放置10h，捞出后用自来水洗掉铬酸，带上手套仔细清洗每张玻片。

原位杂交实验步骤

（2）The acetylation solution（600ml）：triethanolumine 8ml；Conc. HCl 1050μL；DEPC-water 590ml。

（3）PK ：DEPC-PBS 75ml；PK stock(10mg/ml) 37.5μL。

（4）Denaturizing hybridization buffer（20ml）：hybridization buffer 18.25ml；20%CHAPS 250μL；DEPC-water 1480μL；Tween-20 20μL。

（5）溶液B1（1L）：1M tris PH7.5 100ml；5M NaCl 30ml；Sterile water 1L。

（6）溶液B3（1L）：1M tris PH9.5 100ml；5M NaCl 20ml；1M MgCl 50ml；Water up to 1L。

（7）Blocking solution（20ml）：B1 buffer 18ml；FCS 2ml；10%Tween 100μL。

（8）Developer solution（1ml）：B3 buffer 953μL；NBT(17mg/ml) 20μL；BCIP(8mg/ml) 21μL；Levamisol 5μL；Tween 0.5μL。

2、实验步骤（1）石蜡玻片置于二甲苯中浸泡5分钟，两次，室温。

（2）无水乙醇，95%乙醇，75%乙醇和PBS分别浸泡3分钟，室温。

（3）DEPC-PBS浸泡3min×3，室温并准备the acetylation solution。

rna原位杂交的主要实验过程及应用

rna原位杂交的主要实验过程及应用RNA原位杂交（in situ hybridization）是一种用于检测细胞或组织中特定RNA序列的方法。

它主要包括以下实验过程：1. RNA样本固定：细胞或组织样本通常需要被固定在载玻片上，常用的固定剂包括乙醛、乙酰丙酮、PFA等。

2. 去除脂质：在固定的样本中，脂质会干扰RNA与探针的结合，因此需要用脱脂剂去除脂质。

3. 探针制备：选择目标RNA序列的互补序列作为探针，并进行标记，通常标记方式有放射性同位素标记（例如32P、35S）和非放射性标记（例如荧光标记、酶标记）。

4. 杂交：将探针与样本进行杂交，杂交通常在高温下进行，以促进RNA与探针的结合。

5. 洗脱：为了去除非特异性结合的探针，通常进行一系列的洗脱步骤，洗脱条件可以根据具体的实验目的进行调整。

6. 可视化与检测：如果探针采用放射性标记，可以将载玻片放置于感光胶片上，在放射性衰变的辐射下使胶片曝光，然后显影胶片以检测探针的信号；如果探针采用非放射性标记，可以直接通过荧光显微镜观察探针的发光信号。

RNA原位杂交主要应用于以下领域：1. 研究基因表达：可以确定细胞或组织中特定基因的表达模式，帮助揭示基因的功能和调控机制。

2. 分析细胞类型和结构：可以确定细胞或组织中特定RNA序列的分布情况，帮助研究细胞类型和组织结构。

3. 病理学研究：可以检测病理变化相关基因的表达水平，帮助了解疾病的发生机制和进展过程。

4. 发育生物学研究：可以追踪特定RNA序列在发育过程中的表达变化，帮助研究胚胎发育和器官形成的分子机制。

综上所述，RNA原位杂交是一种重要的实验技术，可以用于研究细胞和组织中特定RNA序列的表达模式及其在生物学和医学领域的应用。

RNA原位杂交是一种研究基因表达的常用技术，通过将标记有特定探针的RNA与细胞内目标RNA进行杂交反应，用于确定RNA在组织或细胞中的位置和表达水平。

其主要实验过程如下：1. 制备RNA探针：根据研究对象的RNA序列设计合适的探针，可以使用放射性标记，如32P或35S，或非放射性标记，如荧光标记（如FITC，Cy3等）。

荧光原位杂交实验具体步骤及方法

荧光原位杂交实验具体步骤及方法用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。