原位杂交实验操作步骤
原位杂交技术的操作详解及小贴士
原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术是一种基因组分析方法，用于确定一些特定DNA序列在细胞或组织中的位置。
该技术可以帮助研究人员了解基因组的结构和功能，以及基因在不同细胞类型中的表达模式。
下面将详细介绍原位杂交技术的操作步骤及一些建议。
操作步骤：1.准备DNA探针：首先需要选择合适的DNA探针，用于与目标DNA序列杂交。
DNA探针可以是标记有荧光分子或放射性同位素的DNA序列，用于在杂交后的图像检测或放射计数。
2.制备标本：从目标细胞或组织中提取DNA，并进行适当的处理步骤以便于杂交反应。
其中的处理步骤包括固定、裂解、脱氧核酸酶处理等。
3.杂交反应：在杂交缓冲液中，加入DNA探针和标本DNA，并进行杂交反应。
杂交条件（包括温度、时间和盐浓度等）会根据探针和目标序列的碱基配对特性进行选择。
对于不同的实验目的，例如检测靶基因在组织中的表达模式，杂交条件需要根据实验要求确定。
4.洗涤：在杂交反应结束后，需要进行洗涤步骤以去除非特异杂交的DNA。
通过在高温、高盐浓度或低温条件下进行洗涤，可以选择性地去除未与目标DNA序列配对的DNA。
5.可视化和成像：根据DNA探针的标记方式，采用不同的方法进行可视化和成像。
对于荧光标记的探针，可以使用荧光显微镜观察，并通过分析图像来确定特定DNA序列的位置。
对于放射性标记的探针，可以使用辐射自显像片、液闪仪或放射计数仪等设备进行检测和计数。
小贴士：1.选择合适的探针：为了获得准确的结果，选择合适的探针非常重要。
探针的特异性和亲和力会直接影响到杂交的特异性和效率。
因此，在设计和合成探针时，需要考虑目标DNA序列的长度、特异性和亲和力等因素。
2.优化杂交条件：杂交条件的优化对于获得准确的结果非常重要。
温度、盐浓度和杂交时间是影响杂交反应的重要因素。
通过调整这些条件，可以增强目标DNA和探针的碱基配对能力，提高杂交特异性和效率。
3.正确选择洗涤条件：洗涤步骤的正确选择可以帮助去除非特异杂交的DNA。
原位杂交实验方法
1，预杂交液和杂交液的配制 2，20Xssc， 2Xssc， 0.2Xssc缓冲液的配制 3，0.1mol PBS缓冲液的配制 4，0.1mol 枸橼酸缓冲液的配制 5，0.1mol TBS缓冲液的配制 6，复合消化液的配制 7，组织细胞打孔液的配制 8，杂交漂洗液 9，过氧化氢封闭液
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3
探针设计方案
1，探针名称 ： 2，适用种属： 3，标记方式：3ˋDIG 4，模板序列： 5，探针序列：
5ˋFAM
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探针杂交原理
1，组织细胞的通透 2，探针长度 3 , 探针浓度和杂交时间 4，杂交中的Tm值和杂交温度 5，杂交严格度 6，预杂交原理 7，杂交后处理
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A-石蜡切片mRNA原位杂交步骤
一，过氧化物酶显色系统 二，碱性磷酸酶显色系统 三，荧光显色方法
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B-冰冻切片mRNA原位杂交步骤
一，过氧化物酶显色系统
二，碱性磷酸酶显色系统
三，荧光显色方法
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7
C-细胞爬片或涂片mRNA原位杂交步 骤
一，过氧化物酶显色系统 二，碱性磷酸酶显色系统 三，荧光显色方法
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附录
1，DAB的配制和使用方法2NBT/BCIP的配制和使用方法
3，苏木素的配制和使用方法
4，核固红的配制和使用方法
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流式细胞仪
D-悬浮细胞的mRNA原位 杂交细胞流式细胞仪步骤
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原位杂交实验方法
适用方法 荧光检测系统 过氧化物酶检测系统 碱性磷酸酶检测系统
石蜡切片
冰冻切片
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细胞涂片和 细胞爬片
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mRNA 原位杂交前实验准备
1，无RNA酶水的处理 2，无RNA酶载玻片的处理 3，标本的防RNA酶的固定 4，探针的稀释和保存 5，DNA探针需变性
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作原位杂交的具体操作包括以下几个步骤：1.样本准备：收集需要研究的细胞或组织样品，并进行固定和处理。
具体处理方法根据研究对象的特点和需求而定，可以涉及蛋白酶消化、脱脂、固定等步骤。
2.产生标记探针：首先要选择合适的探针来检测目标序列。
探针可以是DNA或RNA序列，根据研究对象选择相应的方法进行标记，常见的标记方法有荧光标记、放射性标记和酶标记等。
标记后的探针需要经过纯化和检测，确保标记效果良好。
3.杂交反应：将标记的探针与样本中的DNA或RNA进行杂交反应。
首先需要将样本脱水，并在适当温度下使用探针溶液进行孵育反应，使探针与目标序列发生特异性结合。
杂交温度根据探针和目标序列的互补性来确定，一般在适当的温度下进行持续反应。
4.洗涤：杂交反应结束后，需要进行严格的洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异性结合。
洗涤的条件也根据研究需要而定，可以使用高盐溶液、低盐溶液或有机溶剂等来去除非特异性结合。
5.信号检测：根据具体标记方法的不同，可以使用荧光显微镜、射线计数器或底物染色等方法来检测标记的探针。
通过观察探针的位置和强度，可以得到目标序列在细胞或组织中的分布和表达情况。
6.分析与图像处理：根据实验结果，可以对图像进行定量分析和处理。
现代技术已经能够通过图像软件进行分析和定量，得到原位杂交的定量数据。
原位杂交技术的优点在于可以在细胞或组织水平上观察和定位目标序列的存在和表达情况，为研究基因表达、基因功能以及病理学等提供了强有力的工具。
但是在操作过程中需要注意探针的选择和合成、杂交条件的优化以及样品处理的标准化等问题，以确保实验结果的准确性和可重复性。
原位杂交操作流程
原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1)二甲苯于37°C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4)PBS清洗3分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗10分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37°C孵育15分钟；8)PBS清洗2次，每次3分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次3分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12)PBS清洗2次，每次5分钟；13)预杂交缓冲液孵育30分钟；14)准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85°C加热5分钟，置于冰块中10分钟；15)杂交；第二天16)将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17)PBS清洗3分钟；18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中)，37°C孵育30分钟；19)PBS清洗5分钟；20)室温，2XSSC清洗10分钟；21)37°C，1XSSC清洗10分钟；22)37°C，0.5XSSC清洗10分钟；23)缓冲液A孵育10分钟；24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟；25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim)，37°C孵育3小时；26)缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27)缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时;29)停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30)固红，脱水以及封片进行核的复染。
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1)二甲苯于37C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4)PBS清洗5分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗5分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml，37C孵育10分钟；8)PBS清洗2次，每次5分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次5分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2XSSC清洗10分钟；18）37°C,1XSSC清洗10分钟；19）37°C,0.5XSSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37C孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。
原位杂交技术的具体步骤
原位杂交（In situ hybridization）是一种用于检测核酸序列在细胞或组织中的位置和表
达水平的技术。
下面是原位杂交技术的一般步骤：
1.样品固定：首先，准备需要检测的细胞或组织样品，并将其进行固定。
常用的固定方法包括使用乙醛、乙酸、甲醛等。
2.使DNA或RNA标记：选择适当的探针，它可以是DNA或RNA序列，用于与目标
核酸序列杂交。
标记的方法通常使用荧光染料、酶或同位素等。
3.制备与标记探针配对的杂交缓冲溶液：制备含有探针的杂交缓冲溶液，其中包含适当的盐和添加剂，以提供最佳的杂交条件。
4.杂交：将标记的探针加入样品中，让其与目标序列进行杂交。
这一步可以在高温条件下进行，以增加探针与目标序列的特异性结合。
5.洗涤：进行一系列洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异结合物，提高信号的特异性。
6.反应可视化：根据所使用的标记方式，进行合适的染色或检测步骤，以显示杂交信号。
这可以是荧光显微镜观察、酶反应染色或同位素探测等。
7.结果分析：通过显微镜观察或其他适当的图像分析方法来解读和分析杂交结果。
评估信号的位置、强度和特异性。
这些步骤仅为一般原位杂交的基本流程，具体的实验条件和步骤可能会根据研究目的
和样本类型的不同而有所调整。
原位杂交技术在生物医学研究等领域广泛应用，可以
帮助研究者了解基因表达和变化的空间定位和时序关系。
原位杂交步骤-自己整理的1
原位杂交步骤-⾃⼰整理的1荧光原位杂交试剂及其配制⽅法（以下试剂均需⽤RNase-free⽔配制）：1×PBS：NaCl 8g⁄L、KCl 0.2 g⁄L、Na2HPO4 1.44 g⁄L、KH2PO4 0.24 g⁄L，溶于DEPC处理的去离⼦⽔中，⽤pH 计测其pH，再⽤NaOH调其pH为7.4；PBST：PBS加0.1%吐温-20；LiCI：配4M LiCI 100ml需要LiCI．H20 25.6g，配好后加⼊千分之⼀的DEPC，37℃，12h放置，⾼温灭菌。
4%多聚甲醛（4%PFA）：准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r⁄m）上，待其全部溶解后，⽤棕⾊瓶分装成⼩体积包装，保存于－20℃。
（注：本⽅法与其他⼀些⽂献⽤NaOH和HCl先后调节pH⽽促其溶解的⽅法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采⽤上述⽅法使多聚甲醛缓慢溶解⽽没有采⽤⽂献中提及的⽤NaOH调节其pH⾄10促其溶解后再⽤HCl调节pH的原因，除了⽤⼀般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，也因为不能⽤pH计对其酸碱度进⾏测量，因为它会损坏pH 计）。
取以上各成分，溶于DEPC处理过⼀定量的纯⽔（或双蒸⽔）中，测定其pH(放置⼀段时间待其pH稳定后)，据此以HCl或NaOH来调节其pH值⾄7.4，定容⾄所要求的体积。
（注：根据实际情况，因DEPC处理过的⽔其pH会下降，故本实验中实际上是⽤1mol⁄L的NaOH来调节其pH）。
75%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按75%（V／V）⽐例溶于PBST；50%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按50%（V／V）⽐例溶于PBST；25%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按25%（V／V）⽐例溶于PBST；HYB－溶液：50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、0.1%吐温-20（终浓度）、RNase-free⽔（－20℃）pH6.2HYB＋溶液：HYB－溶液、500ug／ml酵母tRNA、50ug／ml（终浓度）肝素，（－20℃）；pH6.250%甲酰胺／2×SSCT：50%甲酰胺（V／V），2×SSCT（终浓度）；2×SSCT：2×SSCT（终浓度），0.1%吐温-20；MAB马来酸缓冲液（Maleic acid buffer）：100mM maleic acid，150mM NaCl，pH 7.5(20℃)，溶于双蒸⽔，⽤浓缩或固体的NaOH调节pH 为7.5，并过滤除菌（sterile）MABT:MAB，使⽤前加⼊0.1%吐温-20；10×Blocking reagent（阻断剂）：将阻断试剂（Blocking reagent）溶于马来酸缓冲液中，摇晃并在加热器或微波炉上加热，使其终浓度为10％（w/v）；此储存液（原液）需⾼温除菌？（is autoclaved）并分装后保存于－20℃。
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中的位置的技术。
下面将详细介绍荧光原位杂交的具体步骤和相应的详细说明。
1.细胞准备首先，需要准备细胞样本。
可以选择使用原代细胞，细胞悬液或切片等。
2.固定将细胞固定在载玻片或载玻片上面。
固定通常使用的试剂是乙酸乙酯和甲醇的混合物，通常比例为1:33.水合将载玻片中的组织或细胞水合处理。
这一步可以通过将载玻片浸泡在去离子水或缓冲液中进行。
4.处理将载玻片进行预处理，以使DNA或RNA序列更易于杂交。
常用的预处理方法有：-煮沸：将载玻片浸泡在2×SSC（1×SSC：0.15MNaCl,0.015MNa3C6H5O7·2H2O,pH7.0）中，然后置于热盖板上加热至100°C，持续约10-20分钟。
-碱性水解：将载玻片浸泡在10%NaOH中，进行碱性水解，然后在盐溶液中冲洗。
5.杂交探针准备荧光探针或荧光标记的引物。
探针的选择取决于要检测的DNA或RNA序列。
探针的设计通常基于目标序列的序列信息，并且通过化学修饰和荧光标记以增加其杂交效率和检测灵敏度。
6.杂交将探针加到载玻片上的样本上，并与目标序列进行杂交。
杂交过程中，探针与目标序列进行互补配对，形成探针-目标复合物。
杂交的温度取决于探针的碱基组成和目标序列的GC含量。
7.洗涤将载玻片在洗涤缓冲液中进行洗涤，以去除未与目标序列杂交的探针。
8.检测使用荧光显微镜观察载玻片上的标记。
荧光标记的探针将通过荧光显微镜检测获得荧光信号。
根据荧光信号的数量和强度，可以确定目标序列的位置和数量。
9.成像和分析通过拍摄荧光显微镜图像来记录荧光信号。
使用图像处理软件进行图像分析，包括亮度分析和定量信号分析。
总结：荧光原位杂交是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中位置的强大技术。
完整版Fish实验
FISH-荧光原位杂交实验（原位杂交）实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。
掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。
2. 实验原理荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。
FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。
间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。
而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。
rna样品原位杂交流程
rna样品原位杂交流程RNA样品原位杂交是一种用于分析RNA分子在组织或细胞中位置和表达水平的实验技术。
该技术的应用广泛，可以帮助科学家们了解基因表达模式、发现新的基因调控机制以及研究疾病的发生机制。
本文将详细介绍RNA样品原位杂交的流程，并一步一步回答相关问题。
第一步：样品准备在进行RNA样品原位杂交实验之前，首先需要准备好所需的样品。
这通常包括组织切片或细胞培养物。
对于组织切片，可以通过组织切片仪将组织切割成适当的薄片。
对于细胞培养物，可以通过离心将细胞从培养容器中收集起来。
问题1：为什么需要准备样品？样品的准备是RNA样品原位杂交实验的基础。
只有准备好的样品才能正常进行后续的实验步骤。
第二步：固定样品在进行RNA样品原位杂交实验之前，需要使用适当的方法将样品固定。
常用的固定方法包括使用乙醛、甲醛或细胞固定试剂等。
固定样品的目的是保持样品的形态结构，并防止RNA分子的降解。
问题2：为什么需要固定样品？固定样品可以使细胞或组织的结构保持完整，同时保护RNA分子不被降解。
第三步：蛋白酶消化固定的样品往往含有多种蛋白质，这些蛋白质会干扰RNA杂交的过程。
因此，在进行RNA杂交实验之前，需要使用蛋白酶消化来去除细胞或组织中的蛋白质。
常用的蛋白酶包括蛋白酶K和胰蛋白酶。
问题3：为什么需要进行蛋白酶消化？蛋白酶消化可以降低蛋白质的干扰，提高RNA杂交的灵敏度。
第四步：RNA杂交反应在固定样品的基础上，进行RNA杂交反应是RNA样品原位杂交实验的核心步骤。
在这一步骤中，首先需要制备适当的RNA探针。
RNA探针是用于杂交的RNA分子，通常使用具有标记的RNA分子，如荧光标记的RNA 或酶标记的RNA。
问题4：什么是RNA探针？有什么作用？RNA探针是用于杂交的RNA分子，可以通过与RNA样品发生互补配对来检测RNA的位置和表达水平。
制备好的RNA探针会与待测RNA样本杂交，形成稳定的双链结构。
杂交反应可以在一定的温度和时间条件下进行。
10实验四五(三)蛋白质原位杂交
附：Ehrich苏木精中染色 Ehrich苏木精中染色
1、前面片经95％、各级的酒精中入水洗后。 、前面片经95％、各级的酒精中入水洗后。 2、Ehrich苏木精中染色10分钟。 Ehrich苏木精中染色10分钟。 3、在清水中冲洗10min。材料由红色变为兰色， 、在清水中冲洗10min。材料由红色变为兰色， 4、1％伊红Y滴液得2－3分钟。 ％伊红Y滴液得2 5、流水冲洗10－30min。 、流水冲洗10－30min。 6、30％、50％、70％、80％、90％、95％、 30％、50％、70％、80％、90％、95％、 100％的酒精中顺次脱水，每级3 5min。 100％的酒精中顺次脱水，每级3－5min。 7、纯酒精和松节油的混合液（1：1）中5min。 、纯酒精和松节油 松节油的混合液（1 ）中5min。 8、入松节油5min。 、入松节油 松节油5min。 9、用加拿大树胶封藏。
四、显色： 显色： 加显色液反应20 30分钟避光 20- 分钟避光）。 加显色液反应20-30分钟避光）。
五、封片 1、脱水 蒸馏水，50%乙醇 乙醇， 乙醇， PBS ，蒸馏水，50%乙醇， 70% 乙醇， 80%乙醇 乙醇， 90%乙醇 95%乙醇 乙醇， 乙醇， 80%乙醇， 90%乙醇，95%乙醇， 100%乙醇，100%乙醇各10分钟。 100%乙醇，100%乙醇各10分钟。 乙醇 乙醇各10分钟 透明½无水乙醇） 1/2松节油 松节油， 2、透明½ 无水乙醇） 1/2松节油， 松节油I 松节油II 10分钟 封片。 II各 分钟， 松节油I，松节油II各10分钟，封片。 4、镜检
6、Solution A洗四次，15分钟/次。 A洗四次 15分钟 洗四次， 分钟/ 加二抗2小时。 7、加二抗2小时。 A洗四次 洗四次， 15分钟 分钟/ 8、Solution A洗四次， 15分钟/次。
荧光原位杂交操作步骤
荧光原位杂交操作步骤荧光原位杂交听起来很复杂呢，其实操作步骤也有章可循啦。
一、样本准备。
要做这个实验，先得把样本处理好。
如果是细胞样本的话，就得把细胞乖乖地固定在载玻片上，就像把小娃娃放在小床上一样安稳。
这一步可不能马虎，固定不好后面就不好办啦。
要是组织样本呢，得把组织切成薄片，薄到像纸片一样精致才行。
然后同样把它固定好，这就为后面的杂交打下了好基础。
二、探针准备。
接下来就是探针啦。
探针就像是专门去找目标的小侦探。
得按照实验要求把探针配好，浓度要刚刚好哦，太浓了可能会乱了阵脚，太稀了又可能找不到目标。
把探针在合适的缓冲液里调配好，就像给小侦探准备好装备一样。
三、杂交反应。
然后就到了杂交这一步啦。
把准备好的探针滴到有样本的载玻片上，再盖上盖玻片。
这时候就像把小侦探放到了有目标的地方，让它们去寻找匹配的东西。
然后把载玻片放到一个合适温度的环境里，这个温度很关键呢，就像给小侦探们创造一个舒适的工作环境。
在这个环境里让探针和样本中的目标DNA或者RNA去结合，这个过程需要一点时间，就像小侦探寻找目标也不能太着急呀。
四、洗涤。
杂交完了之后呢，就要把那些没有结合的多余探针洗掉。
这就像是把那些凑热闹的家伙赶走，只留下真正找到目标的小侦探。
用合适的洗涤液轻轻地洗，可不能太粗暴，不然把已经结合好的也冲走了就糟糕啦。
五、检测。
最后就是检测啦。
这时候要用专门的荧光显微镜去看。
打开显微镜，就像打开一个神秘的宝藏盒子。
如果杂交成功了，就能看到漂亮的荧光信号啦，就像在黑暗中看到了闪闪发光的小星星。
那些荧光信号所在的地方就是探针找到目标的地方呢。
荧光原位杂交虽然有点复杂，但是按照这些步骤一步一步来，就像照顾小宠物一样细心，也能顺利完成这个有趣的实验啦。
原位杂交实验流程
原位杂交实验流程
原位杂交实验是一种将核酸探针与细胞或组织切片上的DNA或RNA进行杂交，从而对特定核酸进行定位和定量分析的方法。
以下是原位杂交实验的一般流程：
1. 样品制备：获得待检测的样品，可以是细胞、组织、细胞核或染色体等。
样品需要进行处理，包括固定、脱水和烘干等步骤，以便于后续的处理。
2. 探针制备：探针是一段具有特定序列的DNA或RNA，用于检测样品中的特定序列。
可以通过化学合成或PCR扩增等方法制备探针。
探针需要标记一定的标记物，如荧光素或辐射性核素等，以便于检测。
3. 杂交反应：将制备好的探针与处理好的样品进行杂交反应。
反应条件包括温度、盐浓度、pH值等，需要根据探针和样品的特性进行调整。
杂交后，探针会与样品中的特定DNA序列结合，并形成探针-目标DNA复合物。
4. 洗涤：杂交后，需要用洗涤液将未结合的探针洗去，以减少背景信号。
洗涤条件需要根据探针和样品的特性进行选择。
5. 检测：在洗涤后，通过特定的检测方法对探针-目标DNA复合物进行检测。
常用的检测方法包括荧光显微镜观察、放射自显影、免疫组织化学染色等。
6. 结果分析：根据检测结果，对杂交信号进行分析和解释。
通常需要比较杂交信号与已知标准品的信号，以确定样品中是否存在目标核酸序列。
7. 实验重复：为了确保结果的可靠性和准确性，通常需要进行重复实验，并对不同实验条件下的结果进行比较和分析。
总之，原位杂交实验需要精心设计和严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可靠性。
原位杂交实验步骤
(一)原位杂交1、溶液配置：（1）Hybridization buffer（20ml）：Formamide 10ml；20x SSC 5ml；Denhand’s2ml；100mg/ml yeast tRNA 50μL；10mg/ml salmon sperm DNA 1ml；Blocking regent 0.4g；DEPC-water 1.95ml。
（2）The acetylation solution（600ml）：triethanolumine 8ml；Conc. HCl 1050μL；DEPC-water 590ml。
（3）PK ：DEPC-PBS 75ml；PK stock(10mg/ml) 37.5μL。
（4）Denaturizing hybridization buffer（20ml）：hybridization buffer 18.25ml；20%CHAPS 250μL；DEPC-water 1480μL；Tween-20 20μL。
（5）溶液B1（1L）：1M tris PH7.5 100ml；5M NaCl 30ml；Sterile water 1L。
（6）溶液B3（1L）：1M tris PH9.5 100ml；5M NaCl 20ml；1M MgCl 50ml；Water up to 1L。
（7）Blocking solution（20ml）：B1 buffer 18ml；FCS 2ml；10%Tween 100μL。
（8）Developer solution（1ml）：B3 buffer 953μL；NBT(17mg/ml) 20μL；BCIP(8mg/ml) 21μL；Levamisol 5μL；Tween 0.5μL。
2、实验步骤（1）石蜡玻片置于二甲苯中浸泡5分钟，两次，室温。
（2）无水乙醇，95%乙醇，75%乙醇和PBS分别浸泡3分钟，室温。
（3）DEPC-PBS浸泡3min×3，室温并准备the acetylation solution。
原位杂交步骤自己整理的精讲
荧光原位杂交试剂及其配制方法（以下试剂均需用RNase-free水配制）：1×PBS：NaCl 8g∕L、KCl 0.2 g∕L、Na2HPO4 1.44 g∕L、KH2PO4 0.24 g∕L，溶于DEPC处理的去离子水中，用pH 计测其pH，再用NaOH调其pH为7.4；PBST：PBS加0.1%吐温-20；LiCI：配4M LiCI 100ml需要LiCI．H20 25.6g，配好后加入千分之一的DEPC，37℃，12h放置，高温灭菌。
4%多聚甲醛（4%PFA）：准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r∕m）上，待其全部溶解后，用棕色瓶分装成小体积包装，保存于－20℃。
（注：本方法与其他一些文献用NaOH和HCl先后调节pH而促其溶解的方法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采用上述方法使多聚甲醛缓慢溶解而没有采用文献中提及的用NaOH调节其pH至10促其溶解后再用HCl调节pH的原因，除了用一般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，也因为不能用pH计对其酸碱度进行测量，因为它会损坏pH 计）。
取以上各成分，溶于DEPC处理过一定量的纯水（或双蒸水）中，测定其pH(放置一段时间待其pH稳定后)，据此以HCl或NaOH来调节其pH值至7.4，定容至所要求的体积。
（注：根据实际情况，因DEPC处理过的水其pH会下降，故本实验中实际上是用1mol∕L的NaOH来调节其pH）。
75%甲醇／PBST：将无水甲醇按75%（V／V）比例溶于PBST；50%甲醇／PBST：将无水甲醇按50%（V／V）比例溶于PBST；25%甲醇／PBST：将无水甲醇按25%（V／V）比例溶于PBST；HYB－溶液：50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、0.1%吐温-20（终浓度）、RNase-free水（－20℃）pH6.2HYB＋溶液：HYB－溶液、500ug／ml酵母tRNA、50ug／ml（终浓度）肝素，（－20℃）；pH6.250%甲酰胺／2×SSCT：50%甲酰胺（V／V），2×SSCT（终浓度）；2×SSCT：2×SSCT（终浓度），0.1%吐温-20；MAB马来酸缓冲液（Maleic acid buffer）：100mM maleic acid，150mM NaCl，pH 7.5(20℃)，溶于双蒸水，用浓缩或固体的NaOH调节pH 为7.5，并过滤除菌（sterile）MABT:MAB，使用前加入0.1%吐温-20；10×Blocking reagent（阻断剂）：将阻断试剂（Blocking reagent）溶于马来酸缓冲液中，摇晃并在加热器或微波炉上加热，使其终浓度为10％（w/v）；此储存液（原液）需高温除菌？（is autoclaved）并分装后保存于－20℃。
一种在g-显带的玻片上进行分子荧光原位杂交处理方法
一种在g-显带的玻片上进行分子荧光原位杂
交处理方法
分子荧光原位杂交技术（FISH）是一种重要的生物学技术，它能够检测和定位细胞核中的特定DNA序列。
在g-显带玻片上进行分子荧光原位杂交处理，可以用于研究染色体结构和基因组变异。
以下是在g-显带玻片上进行分子荧光原位杂交处理的基本步骤：
１．预处理玻片：在开始实验前，需要将玻片进行预处理，包括清洗、脱蜡、消化等步骤，以去除玻片表面的杂质和固定细胞。
２．制备探针：选择与目标DNA序列互补的DNA或RNA片段作为探针，将其标记上荧光染料或其他可检测的标记物。
３．杂交反应：将制备好的探针与玻片上的染色体进行杂交，使探针与目标DNA序列结合。
这一步需要控制杂交温度和时间，以确保探针与目标DNA的有效结合。
４．洗涤：杂交反应后，需要将未结合的探针洗涤掉，以避免背景干扰。
这一步需要严格控制洗涤条件，如洗涤液的成分、温度和时间等。
５．检测与分析：最后，使用荧光显微镜或其他检测设备对染色体的荧光信号进行检测和分析。
通过观察荧光信号的位置和强度，可以推断出染色体结构和基因组变异的情况。
总之，在g-显带玻片上进行分子荧光原位杂交处理需要严格控制实验条件和处理步骤，以确保结果的准确性和可靠性。
荧光原位杂交(FISH)实验步骤
FISH（原位杂交）SOP流程------探针直接带荧光标记一、FISH实验步骤1、石蜡切片脱蜡至水：将挑选好的组织切片置于切片架上放入烘箱中65℃烤片2-3h（观察组织周围石蜡是否被熔化流至切片边缘），烤片完成后将组织切片放入脱蜡机中脱蜡。
脱蜡完成后取出切片，进行抗原修复。
2、抗原修复：脱蜡完成后取出切片，进行酶修复。
稍甩净切片上水分，水平放置在孵育盒，用组化笔在组织周围画圈（过程中组织不能干片，组化笔不能碰到组织，否则会损坏组织或使抗体无法孵育到组织；不可用力按压组化笔以免笔内液体流出覆盖组织），蛋白酶K（PK）37度孵育15-20min，修复完后用PBS冲洗，再将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、固定：甩去残留在片子上的PBS，滴加4%多聚甲醛，室温孵育5min。
用PBS冲洗。
再将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、预杂交：滴加Hyb buffer（预杂交液）55度避光预杂交2小时。
5、准备探针：将探针原液与Hyb buffer按比例稀释，混合均匀后85℃变性3min,37℃平衡2min。
6、杂交：预杂交结束后，吸去Hyb buffer，滴加平衡后的杂交工作液，切片平放于湿盒内，37-42°C（杂交温度依据探针TM值确定）孵育过夜（湿盒内加少量水防止杂交液蒸发）。
7、洗涤：用1XSSC冲洗，浸泡2min。
（洗涤时间不宜过长，可能会洗掉表达）。
8、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育20min。
9、封片：PBS冲掉DAPI，切片稍甩干后用WGA封片剂封片（封片时应避免组织上出现气泡）。
10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。
（蓝光紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）二、荧光结果判读DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光。
基因组原位杂交实验程序（双色）
双色原位杂交程序小样法CT AB法提取植物DNA1.将样品幼嫩叶片放在研钵中，加入800μl2%CTAB充分研磨，转入1.5ml离心管中，2. 65℃水浴1h（每20min反转摇匀一次）；60-65℃水浴30-40分钟都可。
3. 加等体积的氯仿－异戊醇（体积比24：1），或加入苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀；4. 12000rpm离心15min，取上清于新管中；5. 重复4，5步骤；（可略去）6. 向上清中加入2倍体积的无水乙醇（或2/3体积的异丙醇）沉淀DNA，-20℃放置20min 或更长时间，或过夜；7.排出絮状DNA or 离心去上清。
8. 加75％的乙醇or76%+NH4AC（10mmol/L）清洗DNA，洗3次，去上清；干燥过夜。
9. 风干后加入100-300ul的1：100的RNA酶：水的混合液或ddH2O溶解DNA；10. 取2ul溶液电泳检测。
探针标记50ng/μl①1×DNA polymerase Ⅰbuffer（1×） 5 μl②dNTP（10μM） 5 μl③Bio-11-dUTP or Dig-11-dUTP（1mM） 1.2 μl④DNase Ⅰ (0.005U/μl) 1μl⑤DNA polymerase Ⅰ (coli.10U/μ) 1.2μl⑥DNA（2.5μg）Xμl⑦ddH2O 36.6-Xμl⑧Total 50μl混匀后置于原位PCR15℃4h，然后利用1％的琼脂糖凝胶检测片段大小，在100－500bp 左右表示酶切完全。
封阻基因组DNA在沸水中处理10-30min, 然后用1％的琼脂糖凝胶检测片段大小，在100－500bp即可作封阻。
原位杂交制片1．酶解用玻片的准备将新的玻片放到80％浓硫酸配制的铬酸溶液（24g三氧化铬溶于200ml水，加浓硫酸至1000ml冰上操作）中室温下至少放置10h，捞出后用自来水洗掉铬酸，带上手套仔细清洗每张玻片。
rna原位杂交的主要实验过程及应用
rna原位杂交的主要实验过程及应用RNA原位杂交（in situ hybridization）是一种用于检测细胞或组织中特定RNA序列的方法。
它主要包括以下实验过程：1. RNA样本固定：细胞或组织样本通常需要被固定在载玻片上，常用的固定剂包括乙醛、乙酰丙酮、PFA等。
2. 去除脂质：在固定的样本中，脂质会干扰RNA与探针的结合，因此需要用脱脂剂去除脂质。
3. 探针制备：选择目标RNA序列的互补序列作为探针，并进行标记，通常标记方式有放射性同位素标记（例如32P、35S）和非放射性标记（例如荧光标记、酶标记）。
4. 杂交：将探针与样本进行杂交，杂交通常在高温下进行，以促进RNA与探针的结合。
5. 洗脱：为了去除非特异性结合的探针，通常进行一系列的洗脱步骤，洗脱条件可以根据具体的实验目的进行调整。
6. 可视化与检测：如果探针采用放射性标记，可以将载玻片放置于感光胶片上，在放射性衰变的辐射下使胶片曝光，然后显影胶片以检测探针的信号；如果探针采用非放射性标记，可以直接通过荧光显微镜观察探针的发光信号。
RNA原位杂交主要应用于以下领域：1. 研究基因表达：可以确定细胞或组织中特定基因的表达模式，帮助揭示基因的功能和调控机制。
2. 分析细胞类型和结构：可以确定细胞或组织中特定RNA序列的分布情况，帮助研究细胞类型和组织结构。
3. 病理学研究：可以检测病理变化相关基因的表达水平，帮助了解疾病的发生机制和进展过程。
4. 发育生物学研究：可以追踪特定RNA序列在发育过程中的表达变化，帮助研究胚胎发育和器官形成的分子机制。
综上所述，RNA原位杂交是一种重要的实验技术，可以用于研究细胞和组织中特定RNA序列的表达模式及其在生物学和医学领域的应用。
RNA原位杂交是一种研究基因表达的常用技术，通过将标记有特定探针的RNA与细胞内目标RNA进行杂交反应，用于确定RNA在组织或细胞中的位置和表达水平。
其主要实验过程如下：1. 制备RNA探针：根据研究对象的RNA序列设计合适的探针，可以使用放射性标记，如32P或35S，或非放射性标记，如荧光标记（如FITC，Cy3等）。
原位杂交实验步骤
原位杂交实验步骤原位杂交实验呀，就像是一场精心编排的舞蹈。
首先呢，得准备好舞台，也就是标本的处理。
这就好比给舞者们准备一个合适的场地，要把标本固定好，让它稳稳地待在那儿，可不能在中途出啥岔子。
接下来，就是探针的准备啦。
这探针就像是舞蹈的主角，得精心挑选和设计。
它要能准确地找到自己的目标，和标本上特定的序列结合。
然后，杂交这一步可太关键啦！就像舞者们在舞台上的精彩互动。
让探针和标本在合适的条件下相遇、结合，产生奇妙的反应。
之后呢，要进行信号的检测。
这就好比要看到舞者们的精彩表现呈现出来的效果。
通过各种方法，让杂交后的信号能够清晰地被我们看到。
再说说洗片这一步吧，就像是给舞台打扫干净。
把多余的杂质、干扰都去掉，只留下最精彩的部分。
整个过程中，每一步都得小心翼翼，就跟跳舞时每个动作都要精准到位一样。
要是哪一步出了差错，那可就像舞蹈中出现了失误，会影响整个演出的效果呀！做原位杂交实验，还得有耐心。
不能着急忙慌的，得一步一步慢慢来。
就像跳舞，不能一下子就跳到结尾，得按照节奏，一个动作一个动作地来。
而且呀，实验环境也很重要呢。
温度啦、湿度啦，都得控制好，这就好比舞蹈的灯光、音响，得配合得恰到好处，才能让整个表演更加完美。
想象一下，如果标本处理得不好，那后面的步骤不就都白费啦？或者探针没准备好，那还怎么去找到目标呢？所以啊，每一步都不能马虎，都得认真对待。
这原位杂交实验，可不就是一场科学与技术的精彩舞蹈嘛！咱可得把这场舞跳好，跳出精彩，跳出成果来！这就是原位杂交实验的步骤啦，大家可都得记住咯！。
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原位杂交实验操作步骤一质粒制备1质粒的转化和扩增1.1制备XL1-Blue感受态细菌1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中，37℃、100rpm 培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌，冰浴30min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200μ/tube)，-80℃保存。
2.转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng/μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。
3.轻轻摇匀，冰浴30min。
4.42℃热激9O秒，然后迅速冰浴2min。
5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37℃，100转/min水浴孵育60min。
6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1μl/ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培养12-16h。
1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落1.用无菌牙签挑取单菌落，接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37℃，200转/分培养2h，取1ml之一Eppendorf离心管，加50μl10mmol/L EDTA(pH8.0)。
2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振荡30秒。
3.在70℃温育5min，然后冷却到室温。
4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。
5.12000g，4℃离以3min，以除去细菌碎片。
6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。
恒压50V，进行电泳。
7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA 分于量的大小是否与转入质粒相符。
1.3质粒的扩增和纯化1.用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30mlLB-氨苄青霉素(50μg/ml)培养液的聚丙烯管中，于37℃，200转/分培养3h。
2.将菌液转入含70mlLB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中，37℃，200转/分培养过夜(12-16h)，细菌浑浊。
3.菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，终浓度为170μ/ml)。
37℃，200转/分培养12-16h。
4.将培养的细菌倒入50ml的离心管中，6000rpm，4℃离,th,15min，沉淀细菌。
5.弃净上清夜，用2ml预冷的溶液I，悬浮菌体沉淀，剧烈振荡，于室温静置5min6.加入新配制的溶液II4ml，快速用手晃动10秒，颠倒数次后，于室温静置10min。
7.加入预冷的溶液III3ml，温和振荡l0秒，于冰上静置10min，出现白色絮状沉淀。
8.6000rpm，4℃离心15min，保留上清。
9.将上清(若带细菌残片，则再次离心)移入另一50ml的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇混匀，于室温静置10min。
(或-20℃4h，或4℃过夜，可便核酸沉淀)10.12000rpm，4℃离心15min，回收核酸。
小心弃去上清，倒置离心管使残兼上清液流尽。
11.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000rpm离心，15min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
12.用500μlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀，转移至1.5mlEppendorf管中。
13.加入用冰预冷的5mol/L的LiCl溶液600μl，充分混匀。
12000rpm，4℃离心15min，以沉淀高分子量的RNA。
14.将上清转移到另一1.5mlEppendorf管中，加等量异丙醇，充分混匀，于室温静置10min。
15.12000rpm,4℃离心15min，回收核酸。
小心弃去上清，倒置离心管使残余上清液流尽。
16.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000rpm离心，15min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
17.400μl含无DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转移到另-1.5mlEppendorf管中，室温放置1.5mlEppendorf管中30min。
18.加入400μl13%(v/v)的PEG8000-NaCl(1.6mol/L)，混匀，4℃12000rpm离心5min以回收质粒DNA，弃去上清。
19.加入400μlTE缓冲液(pH8.O)溶解沉淀，再分别用等体积的Tris饱和酚、酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。
20.将水相(上清)移入另一1.5mlEppendorf管中，加入O.1体积(约50μ13M的醋酸钠(pH5.2)和2倍体积(大约1ml)的无水乙醇，充分混匀后于4℃放置30min。
21.于4℃12000rpm离心5min回收沉淀的质粒DNA。
尽可能弃去上清，敞开管口，置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。
22.加入400μl处于4℃的70%乙醇，稍加振荡，漂洗沉淀，4℃12000rpm离心2min。
23.吸去上清，室温敞开管口，直到乙醇完全挥发。
24.用100μlTE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀。
25.取4μl溶液1：100稀释后，测定其OD260、OD280，以确定质粒DNA的纯度和浓度(OD260/OD280>1.8。
OD260/OD280对DNA而言其值大约为1.8，高于2.0则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。
;DNA浓度=OD260X0.05X稀释倍数(μg/μl)。
26.质粒DNA溶液于-20℃保存待用。
二、cRNA探针的标记1.将质粒DNA，用相应的限制性内切酶线性化，通过琼脂糖凝胶电泳以确保完全线性化。
2.线性化后的DNA按“质粒的纯化”步骤19-24进行纯化，作为cRNA探针标记的模板，用相应的RNA聚合酶合成地高辛标记的反义和正义RNA探针。
3.进行体外转录，步骤如下：4.在冰上将各试剂加入一1.5ml无RNA酶的Eppendorf管中。
三、原位杂交3.1冰冻切片与杂交前预处理1. 将子宫样品从-80 ℃取出，用OCT包埋，在-23 ℃(切片机腔体温度)平衡至少30 min。
将包埋好的样品固定在样品头上，切10μm厚的连续组织切片，平铺于涂有多聚赖氨酸(1mg/m1)的玻片上(玻片预先经180 ℃干烤6小时)，保存于-70 ℃冰柜备用。
2. 冰冻切片经室温干燥10 min后，在4%的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lO min。
3. 活跃的DEPC-PBS(未高压的0.1%DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5 min。
4. 在0.2M的盐酸作用中作用10 min后，重复步骤4)。
5. 在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg/m1)，37 ℃孵育15 min，重复步骤4)。
6. 经0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25%AA/0.1M TEA (乙酸酐/三乙醇胺，pH 8.0)中乙酰化10 min。
(在大多数实验中，步骤4，5，6省略)7. 5 x SSC中平衡15 min。
3.2杂交8. 在脱水后的玻片上滴加预杂交液(约100 μl/玻片)，置于放有湿盒液(50% 甲酰胺v/v;0.3 M NaCl;1Mm EDTA;10 mM Tris-Cl，pH 8.O)的湿盒中，55～58 ℃下的烘箱中预杂交2 h。
9. 甩掉预杂交液，地高辛标记的反义或正义cRNA探针(浓度1-2ng/μl)经70 ℃变性1O分钟，置冰上1 min，玻片上滴加预杂交液(约60μl/玻片)，覆盖parafilm膜，放湿盒中在48～58 ℃下杂交18-30 h。
3.3杂交后处理1O.取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉杂交液，用52 ℃预热的5×SSC洗30 min。
11.在无DNA的RNA酶A(20μg/ml)溶液中37 ℃下孵育30 min。
12.分别依次用52 ℃预热的2 X SSC，1 X SSC和O.1 X SSC洗2次，每次30 min。
3.4杂交信号检测13.在缓冲液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.5，0.15M NaC1)中平衡5min。
14.在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1：500～1:2000稀释于含0.5%阻断液的缓冲液A中)，室温反应2h。
15.用缓冲液A洗2次，每次15 min。
16.在缓冲液B(0.1M Tris-HCl;0.1M NaCl;0.05M MgCl_2，pH 9.5)中平衡5min。
17.硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐(BCIP)溶于缓冲液B中，每ml缓冲液B含有4.5μ1 NBT和3.5μ1 BCIP。
在玻片上滴加混合染液在湿盒中显色过夜。
18.充分显色后，用EDTA(1 mM EDTA，pH 8.0)洗15 min终止反应。
19.在95%乙醇中洗l h以除去非特异的背景。
20.用蒸馏水洗15 min除去可能存在的结晶体。
21.脱水、透明，用中性树胶封片。
22.充分干燥后在显微镜下观察、照相。
探针标记方法有①DNA的缺口平移法。
缺口平移是一种快速、简便、成本相对较低以及生产高比活性均一标记DNA的方法。
该技术可以制备序列特异的探针。
当使用重组质粒探针时，虽然任何形式的双链DNA都可以进行缺口平移标记。
但通常使用限制性核酸内切酶将插入片段进行酶切和凝胶电泳纯化后再进行缺口平移标记。
此外，用这种探针进行杂交可产生较低的背景信号。
②DNA的随机引物法。
这种方法是使用寡核苷酸引物和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来标记DNA片段。
这种方法可代替缺口平移产生均一的标记探针外，还在许多方面优于缺口平移法，比如标记核苷酸在DNA探针中的掺入率可达50％以上。
由于在反应过程中加入的DNA片段不被降解，故在随机引物反应中加入的DNA可少于200 ng，甚至10 ng也能有效地标记。
DNA片段的大小不影响标记的结果。
标记物沿所加入的全长DNA被均等地掺入。
标记的探针可以直接使用而不需要去除未掺入的核苷酸；单链双链DNA都可作为随机引物标记的模版。
随机引物可用于较小的DNA片段（100~500 bp），而缺口平移法对大DNA片段（>1000 bp）效果最好。
随机引物法的主要缺点是产生的标记探针量比缺口平移的要少些，此外环状DNA不能有效地标记，必须先用限制性内切核酸酶线形化或用碱法或DNA酶Ⅰ产生缺口。
③RNA的体外转录法。
体外转录法标记RNA探针可用于商品化转录质粒来制备。