原位杂交的方法
原位杂交和免疫荧光
原位杂交和免疫荧光
原位杂交和免疫荧光是两种常见的分子生物学实验方法。
这两种
方法都可以用于研究生物分子的定位和分布情况，进而揭示生物学过
程和功能。
下面我们分别来介绍一下这两种方法。
原位杂交是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和定位细
胞或组织中特定的DNA或RNA序列。
原位杂交的基本步骤包括：制备
探针，标记探针，处理样品，杂交和探针探测。
通常情况下，原位杂
交用于检测单个基因或特定基因家族的成员，可用于研究基因组结构、基因表达和基因型等方面。
该技术在医学诊断和药物开发方面也有广
泛应用。
免疫荧光是一种检测生物分子定位和分布情况的常用方法。
它利
用抗体与标记化学物质（如荧光素）相结合，通过荧光显微镜观察生
物分子的定位和分布情况。
免疫荧光主要应用于研究细胞内的蛋白质
定位和分布，也可用于研究病毒感染等方面。
该技术不仅能够静态观
察生物分子的分布情况，还可以通过时间分辨光学显微镜观察生物分
子的动态行为。
虽然原位杂交和免疫荧光技术各自有其独特的应用范围和特点，
但它们有一个共同的优点，即能够在不破坏组织结构的情况下观察分
子分布及定位情况。
这种特性使得这两种技术成为研究生物分子功能
和生物学过程的重要工具。
总之，原位杂交和免疫荧光技术是分子生物学领域内的两个重要
实验方法。
它们都能够在细胞或组织中观察特定生物分子的定位和分
布情况，为揭示生物学过程和功能提供帮助。
原位杂交实验具体步骤及详细方法
原位杂交实验具体步骤及详细方法原位杂交组织(或细胞)化学(In situ Hybridization Histochemistry，ISHH) 简称原位杂交(In Situ Hybridization)，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。
根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。
根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。
直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。
间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。
尽管同位素标记(如35S，3H，32P 等)仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针)，更引起科技工作者的极大兴趣。
一、基本要求组织取材：组织取材应尽可能新鲜。
由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。
固定目的是：(1)保持细胞结构；(2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；(3)使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂(如戊二醛)不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：(1)稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。
组织和细胞标本亦可用0.2M HCl处理10min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。
(2)去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。
单细胞荧光原位杂交技术基础分析
单细胞荧光原位杂交技术基础分析单细胞荧光原位杂交技术（single-cell fluorescent in situ hybridization，scFISH）是研究个体细胞基因组结构和功能的重要手段。
它通过特定的荧光标记探针与细胞内核酸靶点的结合来实现对单个细胞的基因表达模式分析。
本文将对单细胞荧光原位杂交技术的基本原理、方法以及在研究领域的应用进行详细介绍。
一、基本原理单细胞荧光原位杂交技术利用高度特异的核酸探针与细胞内特定的目标序列结合，通过荧光信号的检测来观察细胞的基因表达模式。
其原理主要包括以下步骤：1. 探针设计：根据所研究的基因或序列，设计特异性的DNA或RNA探针。
探针通常标记有荧光染料或荧光素，以便在显微镜下直接观察。
2. 细胞固定：将待研究的细胞进行固定，以保持其形态结构不变。
固定方法可以使用化学物质如乙醇或乙酸乙酯，或者采用热处理方法。
固定后，细胞的DNA或RNA会在某种程度上变性，使得探针能够更好地与其结合。
3. 探针杂交：将设计好的探针与固定的细胞一起进行孵育反应，使其在一定的温度和盐度条件下与目标序列发生特异性结合。
探针可以是产生互补序列的DNA或RNA，以便与目标序列形成特异性的双链结构。
4. 检测信号：利用荧光显微镜或其他适当的检测设备观察探针与目标序列的结合情况。
荧光标记的探针在特定波长下会发出荧光信号，通过检测信号的强度和位置，可以确定基因的表达量和位置。
二、方法步骤单细胞荧光原位杂交技术的实施通常包括以下几个步骤：1. 细胞样品处理：获取待研究的细胞样品，并进行适当的处理，如培养、分离、固定等。
处理过程中需注意细胞的完整性和特定的实验条件。
2. 探针设计和制备：根据研究目的选择合适的目标序列和探针设计方法。
针对目标基因或序列，用合成的核酸片段进行探针标记或直接购买商业化的标记好的探针。
3. 探针反应：将待研究的细胞样品与探针进行孵育反应。
反应条件应根据探针设计和实验需求进行优化，包括反应温度、时间和缓冲液的选择等。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作原位杂交的具体操作包括以下几个步骤：1.样本准备：收集需要研究的细胞或组织样品，并进行固定和处理。
具体处理方法根据研究对象的特点和需求而定，可以涉及蛋白酶消化、脱脂、固定等步骤。
2.产生标记探针：首先要选择合适的探针来检测目标序列。
探针可以是DNA或RNA序列，根据研究对象选择相应的方法进行标记，常见的标记方法有荧光标记、放射性标记和酶标记等。
标记后的探针需要经过纯化和检测，确保标记效果良好。
3.杂交反应：将标记的探针与样本中的DNA或RNA进行杂交反应。
首先需要将样本脱水，并在适当温度下使用探针溶液进行孵育反应，使探针与目标序列发生特异性结合。
杂交温度根据探针和目标序列的互补性来确定，一般在适当的温度下进行持续反应。
4.洗涤：杂交反应结束后，需要进行严格的洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异性结合。
洗涤的条件也根据研究需要而定，可以使用高盐溶液、低盐溶液或有机溶剂等来去除非特异性结合。
5.信号检测：根据具体标记方法的不同，可以使用荧光显微镜、射线计数器或底物染色等方法来检测标记的探针。
通过观察探针的位置和强度，可以得到目标序列在细胞或组织中的分布和表达情况。
6.分析与图像处理：根据实验结果，可以对图像进行定量分析和处理。
现代技术已经能够通过图像软件进行分析和定量，得到原位杂交的定量数据。
原位杂交技术的优点在于可以在细胞或组织水平上观察和定位目标序列的存在和表达情况，为研究基因表达、基因功能以及病理学等提供了强有力的工具。
但是在操作过程中需要注意探针的选择和合成、杂交条件的优化以及样品处理的标准化等问题，以确保实验结果的准确性和可重复性。
rna原位杂交技术
rna原位杂交技术RNA原位杂交技术（RNA in situ hybridization）是一种用于研究细胞和组织中特定RNA分子表达的重要实验方法。
它通过特异性杂交的原理，能够对细胞和组织中特定的mRNA或非编码RNA进行定位和可视化，从而揭示基因表达的时空分布情况，为研究基因功能和疾病发生机制提供了有力的工具。
RNA原位杂交技术的基本原理是利用互补的核酸序列进行杂交。
在实验中，首先需要制备一段具有特异性的标记RNA探针，该探针的序列与目标RNA的互补部分相匹配。
标记通常使用放射性同位素或荧光染料进行，以便在细胞或组织中可视化。
在进行RNA原位杂交实验时，首先需要固定样本，以保持细胞和组织的形态结构。
然后，通过脱水和透明化等处理，将样本与RNA 探针进行杂交。
杂交后，通过洗涤去除未结合的探针，然后进行探针的检测。
对于放射性标记的探针，可以使用放射自显影的方法进行可视化；对于荧光标记的探针，可以使用荧光显微镜观察。
RNA原位杂交技术在生命科学研究中具有广泛的应用。
它可以用于研究胚胎发育过程中基因表达的时空分布，揭示基因在不同发育阶段和不同组织中的表达模式。
此外，RNA原位杂交技术还可以用于研究肿瘤的发生和发展机制，通过检测癌细胞中特定基因的表达情况，揭示肿瘤细胞的分化状态和侵袭能力。
近年来，随着高通量测序技术的发展，RNA测序已经成为研究基因表达的主流方法。
然而，与RNA测序相比，RNA原位杂交技术具有直接观察细胞和组织中RNA表达的优势。
它可以提供细胞和组织层面的信息，揭示基因在空间上的分布和相互作用。
因此，RNA 原位杂交技术与RNA测序技术相辅相成，共同推动了基因表达研究的深入发展。
尽管RNA原位杂交技术在研究中具有重要意义，但也存在一些局限性。
首先，由于RNA原位杂交实验需要杂交探针与目标RNA的互补配对，因此对探针的设计和合成具有一定的挑战性。
其次，在实验过程中，样本的固定和处理等步骤可能会对RNA的结构和表达产生一定的影响，因此需要进行严格的实验控制。
荧光原位杂交(FISH)操作方法
荧光原位杂交（FISH）1.样品处理与固定(约4h，可提前准备)（1）用纯水清洗样品数次，加1×PBS，涡旋悬浮样品，离心（2000r/min）5min 弃去上清液；（2）在样品中加入4%多聚甲醛（终浓度4%），置于4℃固定3小时左右；（3）离心（12000r/min）5min，弃去上清液；（4）加1×PBS摇匀清洗3次，离心（10000r/min）5min弃去上清液；（5）加0.5mL1×PBS和0.5mL乙醇，重悬样品，-20℃可保存6个月。
2.载玻片涂层处理（约2.5h，可提前准备）（1）将载玻片用盐酸乙醇溶液中（1份盐酸2份乙醇）浸洗10min，然后用自来水水充分清洗，再用纯水清洗2-3遍，100%乙醇中贮存备用；（2）拿出玻片晾干后，滴一滴poly-L-lysine（0.1mg/mL）溶液于载玻片上，覆盖样品孔，室温放置10-30min分钟；（3）吸去多余的溶液，用无菌水冲洗表面数次；（4）接种前至少室温干燥1小时或过夜晾干。
3.透化与脱水（约1h）现配proteinase k buffer：50mL1M Tris/HCl0.5mL0.5M EDTA1mL5M NaCl1mL10%SDS 2.5mLdd H2O to50mL pro.k(20mg/mL)25μL（1）取适量固定后样品于载玻片上（可提前超声破碎），放入46℃孵育箱中烘干10分钟；（2）将样品浸入蛋白酶k缓冲液中，37℃，20min，然后浸入灭菌水中清洗3次，每次1min。
（3）再依次浸入50%、80%、100%乙醇中脱水，每次3min，最后在空气中晾干。
4.杂交（约2h）（1）加9μL杂交缓冲液到载玻片的样品上，尽量让样品全被覆盖；（2）（此步之后，保证样品充分避光）在杂交缓冲液上加1μL探针（终浓度5ng/μL）；（3）将载玻片水平放在有2×SSC的湿盒中，盖盖，然后一起放入46℃孵育箱中，杂交1.5小时；（4）将冲洗缓冲液预热到48℃，备用。
原位杂交-经典方法-地高辛标记探针
原位杂交(In situ hybridization)一、目的掌握核酸探针原位杂交操作技术，并利用该技术对单细胞的靶目标进行定位，用于细胞生物学基础研究。
二、原理原位杂交技术（in situ hybridization）是分子生物学和组织化学成功结合的产物，是特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行检测的方法。
其基本原理是含互补序列的标记DNA或RNA片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。
原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
三、仪器设备烘箱，切片机，展片机，染色缸，湿盒，原位PCR仪，显微镜、镊子、量筒、烧杯、吸水纸、枪与枪头、载玻片、盖玻片、冰盒等。
四、材料和试剂1．材料：带有病原体的水生动物，如感染WSSV病毒的对虾、感染虹彩病毒的水生动物等。
2．试剂：Davidson’s AFA固定液:330 ml 95％乙醇220 ml 福尔马林（37～39％甲醛水溶液）115 ml 冰醋酸335 ml H2O混匀后封口，室温放置；DIG标记与检测试剂盒（Roche公司）；TNE：50 mmol/L Tris-HCl 6.57 g Tris Base10 mmol/L NaCl 0.58 g NaCl1 mmol/L EDTA 0.37 g EDTAddH2O 900 ml （定容至1L）用HCl调pH至7.4，高压灭菌，4℃保存；0.4% 甲醛：37～39％% 甲醛 5.4 mlddH2O 495 ml；蛋白酶K溶液(Pr.K，10 mg/ml)：10 mg Pr.K 溶于1 ml TNE中（用时现配）；20×SSC：3 mol/L NaCl 175.32 g NaCl0.3 mol/L柠檬酸钠88.23 g 柠檬酸钠ddH2O 900 ml （定容至1L）调pH至7.0，高压灭菌，4℃保存；2×SSC：20×SSC 100 mlddH2O 900 ml0.45 µm 滤膜过滤，4℃保存；20×Denhardt’s溶液：0.4％牛清血蛋白0.4 g牛清血蛋白0.4％聚蔗糖0.4 g聚蔗糖0.4％聚乙烯吡咯烷酮0.4 g聚乙烯吡咯烷酮ddH2O 100 ml0.45 µm 滤膜过滤，4℃保存；25％硫酸葡聚糖：25 g硫酸葡聚糖溶于80 ml ddH2O（定容至100 ml），-20℃保存；杂交液：4×SSC50% 甲酰胺1×Denhardt’s5% 硫酸葡聚糖0.5 mg/ml鲑精DNA4℃保存；BufferI：100 mmol/L Tris-HCl 12.11 g Tris Base150 mmol/L NaCl 8.77 g NaCl用HCl调pH至7.5，定容至1L，高压灭菌，4℃保存，；BufferII：0.5% Blocking agent 0.5 g Blocking agentBufferI 100 ml低温加热溶解，4℃保存一星期；BufferIII：100 mmol/L Tris-HCl 12.11 g Tris Base100 mmol/L NaCl 5.84 g NaCl50 mmol/L MgCl2 10.16 g MgCl2•6H2OddH2O 990 ml（定容至1L）用HCl调pH至9.5，0.45 µm 滤膜过滤，4℃保存；BufferIV：10 mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 1 mmol/LEDTA；显色液（NBT/BCIP使用液）：20 µl NBT/BCIP + 1ml BufferIII。
原位杂交步骤-自己整理的1
原位杂交步骤-⾃⼰整理的1荧光原位杂交试剂及其配制⽅法（以下试剂均需⽤RNase-free⽔配制）：1×PBS：NaCl 8g⁄L、KCl 0.2 g⁄L、Na2HPO4 1.44 g⁄L、KH2PO4 0.24 g⁄L，溶于DEPC处理的去离⼦⽔中，⽤pH 计测其pH，再⽤NaOH调其pH为7.4；PBST：PBS加0.1%吐温-20；LiCI：配4M LiCI 100ml需要LiCI．H20 25.6g，配好后加⼊千分之⼀的DEPC，37℃，12h放置，⾼温灭菌。
4%多聚甲醛（4%PFA）：准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r⁄m）上，待其全部溶解后，⽤棕⾊瓶分装成⼩体积包装，保存于－20℃。
（注：本⽅法与其他⼀些⽂献⽤NaOH和HCl先后调节pH⽽促其溶解的⽅法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采⽤上述⽅法使多聚甲醛缓慢溶解⽽没有采⽤⽂献中提及的⽤NaOH调节其pH⾄10促其溶解后再⽤HCl调节pH的原因，除了⽤⼀般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，也因为不能⽤pH计对其酸碱度进⾏测量，因为它会损坏pH 计）。
取以上各成分，溶于DEPC处理过⼀定量的纯⽔（或双蒸⽔）中，测定其pH(放置⼀段时间待其pH稳定后)，据此以HCl或NaOH来调节其pH值⾄7.4，定容⾄所要求的体积。
（注：根据实际情况，因DEPC处理过的⽔其pH会下降，故本实验中实际上是⽤1mol⁄L的NaOH来调节其pH）。
75%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按75%（V／V）⽐例溶于PBST；50%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按50%（V／V）⽐例溶于PBST；25%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按25%（V／V）⽐例溶于PBST；HYB－溶液：50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、0.1%吐温-20（终浓度）、RNase-free⽔（－20℃）pH6.2HYB＋溶液：HYB－溶液、500ug／ml酵母tRNA、50ug／ml（终浓度）肝素，（－20℃）；pH6.250%甲酰胺／2×SSCT：50%甲酰胺（V／V），2×SSCT（终浓度）；2×SSCT：2×SSCT（终浓度），0.1%吐温-20；MAB马来酸缓冲液（Maleic acid buffer）：100mM maleic acid，150mM NaCl，pH 7.5(20℃)，溶于双蒸⽔，⽤浓缩或固体的NaOH调节pH 为7.5，并过滤除菌（sterile）MABT:MAB，使⽤前加⼊0.1%吐温-20；10×Blocking reagent（阻断剂）：将阻断试剂（Blocking reagent）溶于马来酸缓冲液中，摇晃并在加热器或微波炉上加热，使其终浓度为10％（w/v）；此储存液（原液）需⾼温除菌？（is autoclaved）并分装后保存于－20℃。
荧光原位杂交 FISH 操作方法
荧光原位杂交（FISH）1.样品处理与固定(约4h，可提前准备)（1）用纯水清洗样品数次，加1×PBS，涡旋悬浮样品，离心（2000r/min）5min 弃去上清液；（2）在样品中加入4%多聚甲醛（终浓度4%），置于4℃固定3小时左右；（3）离心（12000r/min）5min，弃去上清液；（4）加1×PBS摇匀清洗3次，离心（10000r/min）5min弃去上清液；（5）加0.5mL1×PBS和0.5mL乙醇，重悬样品，-20℃可保存6个月。
2.载玻片涂层处理（约2.5h，可提前准备）（1）将载玻片用盐酸乙醇溶液中（1份盐酸2份乙醇）浸洗10min，然后用自来水水充分清洗，再用纯水清洗2-3遍，100%乙醇中贮存备用；（2）拿出玻片晾干后，滴一滴poly-L-lysine（0.1mg/mL）溶液于载玻片上，覆盖样品孔，室温放置10-30min分钟；（3）吸去多余的溶液，用无菌水冲洗表面数次；（4）接种前至少室温干燥1小时或过夜晾干。
3.透化与脱水（约1h）现配proteinase k buffer：50mL1M Tris/HCl0.5mL0.5M EDTA1mL5M NaCl1mL10%SDS 2.5mLdd H2O to50mL pro.k(20mg/mL)25μL（1）取适量固定后样品于载玻片上（可提前超声破碎），放入46℃孵育箱中烘干10分钟；（2）将样品浸入蛋白酶k缓冲液中，37℃，20min，然后浸入灭菌水中清洗3次，每次1min。
（3）再依次浸入50%、80%、100%乙醇中脱水，每次3min，最后在空气中晾干。
4.杂交（约2h）（1）加9μL杂交缓冲液到载玻片的样品上，尽量让样品全被覆盖；（2）（此步之后，保证样品充分避光）在杂交缓冲液上加1μL探针（终浓度5ng/μL）；（3）将载玻片水平放在有2×SSC的湿盒中，盖盖，然后一起放入46℃孵育箱中，杂交1.5小时；（4）将冲洗缓冲液预热到48℃，备用。
原位杂交技术
生物素：在动物细胞中是羧化酶的辅酶，在肝、肾、心、
肺等组织中丰富，主要集中在线粒体中。 地高辛：从洋地黄植物的花和叶中提取。
（动物细胞中不存在）
组织样品制备
（一）.去除或抑制RNA酶
方法有两类：
物理方法： 对耐高温的器具如玻璃器皿，不锈钢器具进行高
温烘烤（180-200℃干烤4-6小时）。
原理：碱基互补配对原则
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原位分子杂交
杂交体
杂交条件
严格度概念
DNA-DNA
杂交体
DNA-RNA RNA-RNA
稳定性：
DNA-DNA﹥DNA-RNA ﹥RNA-RNA
稳定性受以下因素影响：甲酰胺浓度 盐浓度等 温度等
原位杂交技术的条件
杂交液 探针浓度 温度 PH 时间
杂交液
对溶液和耐高温塑料器具作高温蒸汽消毒 化学方法：
焦磷酸二乙酯（DEPC） 作用机制：通过与组氨酸结合使蛋白质变性
（二）取材
组织要求新鲜，迅速投入到固定液中 标本置于低温环境下可抑制RNA酶作用
（三）固定
4％多聚甲醛培养2-6小时（培养细胞30分钟）
（四）包埋和切片
常规方法
（五）电镜杂交技术
（六）冷冻切片
冷冻切片保存靶细胞较多，较易获得杂交 信号
原位杂交
（一）杂交前处理
1.灭活内源性酶 在用酶作为报告分子时
（过氧化物酶 碱性磷酸酶）
2.RNA酶处理 3.盐酸和乙酸酐处理 提高杂交效率并降低背景 4.通透处理 消化去除细胞表面和内部特别是靶细胞
周围的蛋白质，增加探针等反应分子对 靶核酸分子的接触机会
温度
杂交时温度一般低于相对杂交体Tm值25℃
mrna原位杂交序列设计
mrna原位杂交序列设计mRNA原位杂交序列设计是一种常用的实验方法，用于研究基因表达的模式和细胞分化过程中基因的空间分布。
本文将介绍mRNA原位杂交序列设计的原理、方法和应用，并探讨其在生物学研究中的意义。
一、mRNA原位杂交序列设计的原理mRNA原位杂交是一种利用亲和性探针与目标mRNA序列特异性结合的技术。
其原理基于亲和性探针与目标mRNA的互补碱基配对，通过标记探针的信号，可以在细胞或组织中可视化目标mRNA的分布情况。
二、mRNA原位杂交序列设计的方法1. 选择目标mRNA序列：根据研究的目的和假设，选择感兴趣的基因和其对应的mRNA序列作为研究对象。
2. 设计亲和性探针：根据目标mRNA序列，设计合适长度的亲和性探针。
探针应具备高度特异性，避免与其他非目标mRNA序列发生杂交。
3. 标记亲和性探针：选择合适的标记方式，如荧光标记或放射性标记等，将亲和性探针标记上信号物质。
4. 杂交：将标记的亲和性探针与样本中的细胞或组织进行杂交反应，使探针与目标mRNA特异性结合。
5. 可视化和分析：利用适当的检测方法，观察探针信号的分布情况，并进行定量或定性分析。
三、mRNA原位杂交序列设计的应用1. 研究基因表达模式：mRNA原位杂交可以用于研究基因在不同组织或细胞类型中的表达模式，揭示基因调控的机制和功能。
2. 研究细胞分化过程：mRNA原位杂交可以追踪和观察细胞分化过程中特定基因的表达变化，深入了解细胞分化的分子机制。
3. 分子诊断：mRNA原位杂交可以用于检测疾病相关基因的表达水平，为疾病的早期诊断和治疗提供依据。
4. 药物研发：mRNA原位杂交可以用于研究药物对特定基因表达的影响，评估药物的疗效和安全性。
mRNA原位杂交序列设计是一种重要的实验方法，可用于研究基因表达的模式和细胞分化过程中基因的空间分布。
该技术具有广泛的应用前景，可以在生物学研究中发挥重要作用。
随着技术的不断发展和创新，相信mRNA原位杂交序列设计将在未来的研究中发挥更大的作用。
荧光原位杂交-更新
荧光原位杂交-更新荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种基于DNA分子杂交技术，可以用于研究细胞核内DNA序列的空间分布，基因表达与功能等问题的一种重要方法。
相比于传统的DNA杂交方法，荧光原位杂交具有高灵敏度、高特异度、高分辨率、无需PCR扩增等优点，被广泛应用于在形态学及遗传水平对真核生物的相关研究。
本文将介绍荧光原位杂交的原理、方法和应用。
一、原理荧光原位杂交的原理是利用标记有荧光染料（如荧光素、rhodamine等）的DNA探针与待检测样品（常为细胞核、染色体、tissue或者section等）中的目标DNA特异性结合，形成稳定的探针-靶DNA杂交物，通过检测荧光发射信号的方法来确定目标DNA序列的位置和数量。
探针的设计是荧光原位杂交成功的关键，因为它们必须具有真确的互补性，绑定到目标DNA的特定区域上。
如何选择探针的特异性，通常取决于所要研究的问题，例如检测某一基因的副本数，探测非编码RNA，或发现肿瘤细胞中的染色体异常等。
二、方法1. 获取样品荧光原位杂交技术所需的样品通常以细胞核或组织切片的形式存在，依据所要研究的问题，通过相应方法处理，如：细胞核的分离、组织的固定剂的处理、剪切不同的组织块、制备Paraffin等经典样品处理方法。
2. 样品前处理对于切片和细胞各种杂质如化学物质、染料、蛋白质等的影响，靠的是样本的处理方法。
主要有以下几种：1) 催化游离的核酸：这一步的主要目的是去除待测样品中的核酸，包括double-stranded 的DNA和single-stranded的RNA。
当使用非常规杂交试剂或非常规探针（如bacterial artificial chromosome、cosmid probe）时，可能需要使用一些高效的去掉毛糙杂质的试剂。
2) 前处理（预处理）：固定、脱水、变性、去除RNA、去除单链DNA（ssDNA）、吉姆萨染色、荧光染色、脱色剂去除等多项操作。
原位杂交实验流程
原位杂交实验流程
原位杂交实验是一种将核酸探针与细胞或组织切片上的DNA或RNA进行杂交，从而对特定核酸进行定位和定量分析的方法。
以下是原位杂交实验的一般流程：
1. 样品制备：获得待检测的样品，可以是细胞、组织、细胞核或染色体等。
样品需要进行处理，包括固定、脱水和烘干等步骤，以便于后续的处理。
2. 探针制备：探针是一段具有特定序列的DNA或RNA，用于检测样品中的特定序列。
可以通过化学合成或PCR扩增等方法制备探针。
探针需要标记一定的标记物，如荧光素或辐射性核素等，以便于检测。
3. 杂交反应：将制备好的探针与处理好的样品进行杂交反应。
反应条件包括温度、盐浓度、pH值等，需要根据探针和样品的特性进行调整。
杂交后，探针会与样品中的特定DNA序列结合，并形成探针-目标DNA复合物。
4. 洗涤：杂交后，需要用洗涤液将未结合的探针洗去，以减少背景信号。
洗涤条件需要根据探针和样品的特性进行选择。
5. 检测：在洗涤后，通过特定的检测方法对探针-目标DNA复合物进行检测。
常用的检测方法包括荧光显微镜观察、放射自显影、免疫组织化学染色等。
6. 结果分析：根据检测结果，对杂交信号进行分析和解释。
通常需要比较杂交信号与已知标准品的信号，以确定样品中是否存在目标核酸序列。
7. 实验重复：为了确保结果的可靠性和准确性，通常需要进行重复实验，并对不同实验条件下的结果进行比较和分析。
总之，原位杂交实验需要精心设计和严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可靠性。
一种在g-显带的玻片上进行分子荧光原位杂交处理方法
一种在g-显带的玻片上进行分子荧光原位杂
交处理方法
分子荧光原位杂交技术（FISH）是一种重要的生物学技术，它能够检测和定位细胞核中的特定DNA序列。
在g-显带玻片上进行分子荧光原位杂交处理，可以用于研究染色体结构和基因组变异。
以下是在g-显带玻片上进行分子荧光原位杂交处理的基本步骤：
１．预处理玻片：在开始实验前，需要将玻片进行预处理，包括清洗、脱蜡、消化等步骤，以去除玻片表面的杂质和固定细胞。
２．制备探针：选择与目标DNA序列互补的DNA或RNA片段作为探针，将其标记上荧光染料或其他可检测的标记物。
３．杂交反应：将制备好的探针与玻片上的染色体进行杂交，使探针与目标DNA序列结合。
这一步需要控制杂交温度和时间，以确保探针与目标DNA的有效结合。
４．洗涤：杂交反应后，需要将未结合的探针洗涤掉，以避免背景干扰。
这一步需要严格控制洗涤条件，如洗涤液的成分、温度和时间等。
５．检测与分析：最后，使用荧光显微镜或其他检测设备对染色体的荧光信号进行检测和分析。
通过观察荧光信号的位置和强度，可以推断出染色体结构和基因组变异的情况。
总之，在g-显带玻片上进行分子荧光原位杂交处理需要严格控制实验条件和处理步骤，以确保结果的准确性和可靠性。
植物组织原位杂交方法
用于检测植物组织RNA的原位杂交法（一）组织切片制备植物组织的甲醛固定和包埋1．将植物组织切成小块，立即放入一个装有10～50ml固定剂溶液的烧杯中，把烧杯放到真空脱水机内。
调节真空度以形成一个温和的真空，然后慢慢恢复常压。
微量便于固定剂渗入组织，必须反复真空和非真空状态。
待固定剂充分渗入组织块后，室温下放置2～3小时。
2．室温下用50～100ml 50mmol/L PIPES缓冲液（pH6.8）漂洗组织块20分钟。
3．室温下将组织块先后放在不同稀释度的乙醇水溶液（25％，50％，75％和100％）中脱水。
每个梯度取50～100ml，各培养20分钟。
4℃下用50～100ml 100％乙醇培育组织块，脱水过夜。
温和的摇动或搅动可以促进组织中溶剂的交换。
4．第二天上午，将组织块转移到50～100ml新的100％乙醇中。
再脱水30分钟。
5．室温下用不同稀释度的二甲苯乙醇溶液（25％，50％，75％和100％）先后浸渗组织块。
每个梯度取用50～100ml，各培育60分钟。
在100％二甲苯中重复培育2次。
6．在60℃下用不同稀释度的Paraplast PlusTM二甲苯溶液（25％，50％，75％和100％）先后浸渗组织块。
每个梯度取用50～100ml，各浸渗2小时。
60℃下用100％Paraplast PlusTM温育组织块，浸渗过夜。
在60℃温育过程中，我们发现水浴加热比在电炉上直接加热更能维持一个稳定的温度。
水浴加热时，必须将放置组织块的烧杯严密封口以防止水汽渗入正在包埋的介质中。
7．至此，组织块可以包埋在Paraplast PlusTM块中了。
为了制备包埋块，首先将机械模具放在载片加热仪上，温度设置在60℃。
避免过分加热。
在模具中倒入熔化的Paraplast PlusTM，将组织块转移到模具内。
用一根细菌接种针安排好它们的位置，然后加入更多熔化了的Paraplast PlusTM。
在模具中插入合适的附架。
miRNA原位杂交
（5）杂交信号的放大
① 加封闭液I、 avidin-FITC，37 ℃温育20min。 ② 42～50 ℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。 ③ 加封闭液II、antiavidin， 37 ℃ 温育20min。 ④ PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
21
ISH：miRNA，参考PMID: 30233621
03 案例分析
如何撰写------荧光原位杂交
总起句：说明研究的对象是组织还是细胞，以及如何收集
标本的制备及处理：取组织切片，进行上述脱蜡及水饱和处理； 杂交：将切片放在杂交炉上，加入200μL的预杂交液，65℃下预杂交1 h 探针处理：原位杂交滴加终浓度为500ng/mL的LINC01082和miR-17-3p探针杂交液200μL ； 洗脱：湿盒55℃孵育1.5 h，55℃水浴中振荡洗涤25 min； 染色：滴加2-3滴NBT/BCIP避光反应，显色1 h。 杂交信号放大：待染色的信号强度适中时，纯水终止反应； 复染、脱色：核固红染色200μl，复染约1-5 min，在流水下冲洗玻片10 min。按照50%、75%、100 醇的顺序脱水处理，每步5 min； 封片：中性树胶封片，观察取数据并检测
2、第二句开始描述具体方法如下：
标本的制备及处理：在24孔培养板中放入盖玻片，取细胞按6× 104/孔接种 ，使细胞融合率在80%左右；
18
03 案例分析
如何撰写------原位杂交
细胞的固定：取出玻片，PBS清洗后加入1mL 4%多聚甲醛室温固定，经蛋白酶K (2μg/mL) ，甘氨酸，及乙酞化试剂处理 杂交：加入250 μL预杂交液，42℃孵育1 h； 探针处理：吸除预杂交液，加入250 μL含有探针 (300 ng/mL) 的杂交液，42 ℃杂交过夜； 洗脱及染色： PBST清洗3次后，加入用PBST稀释的DAPI (1：800) 染液染核，染色5 min； 封片：用抗荧光猝灭剂封片，荧光显微镜 (Olympus，Japen) 下选取5个不同视野进行观察 并拍照检测
荧光原位杂交实验方法及步骤
荧光原位杂交实验⽅法及步骤2.38.1 实验⽅法及步骤(1) 探针变性将探针在75℃恒温⽔浴中温育5min，⽴即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。
(2) 标本变性a.将制备好的染⾊体玻⽚标本于50℃培养箱中烤⽚2～3h。
(经Giemsa染⾊的标本需预先在固定液中退⾊后再烤⽚)。
b.取出玻⽚标本，将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。
c.⽴即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰⼄醇系列脱⽔，每次5min，然后空⽓⼲燥。
(3) 杂交将已变性或预退⽕的DNA探针10µL 滴于已变性并脱⽔的玻⽚标本上，盖上18×18盖玻⽚，⽤Parafilm封⽚，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜(约15～17h)。
由于杂交液较少，⽽且杂交温度较⾼，持续时间⼜长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进⾏。
(4) 洗脱此步骤有助于除去⾮特异性结合的探针，从⽽降低本底。
a.杂交次⽇，将标本从37℃温箱中取出，⽤⼑⽚轻轻将盖玻⽚揭掉。
b.将已杂交的玻⽚标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。
c.在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5min。
d.在室温下，将玻⽚标本于2×SSC中轻洗⼀下。
e.取出玻⽚，⾃然⼲燥。
f.取200µL复染溶液(PI/antifade或DAPI/antifade染液)滴加在玻⽚标本上，盖上盖玻⽚。
(5) 杂交信号的放⼤(适⽤于使⽤⽣物素标记的探针)a.在玻⽚的杂交部位加150µL封闭液I，⽤保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
b.去掉保鲜膜，再加150µL avidin-FITC于标本上，⽤保鲜膜覆盖，37℃继续温育40min。
c.取出标本，将其放⼊已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。
RNA原位核酸杂交方法
RNA原位核酸杂交方法一、基本原理RNA原位核酸杂交(RNA nucleic acid hybridization in situ)又称RNA原位杂交组织化学(RNA in situ hybridization histochemistry)或RNA原位杂交[6,7,25] (RNA i n situ hybridization RISH)。
该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。
其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体(Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。
RNA原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。
尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。
RNA原位杂交不同于DNA原位杂交主要有：(1)使用的探针不同：RNA原位杂交中多采用RNA或寡核苷酸探针，因此避免了应用双链DNA探针在杂交反应中存在的两条链之间的复性和第二条链的竞争性杂交问题。
cRNA-RNA之间形成的杂交体要比DNA-DNA、cDNA-RNA杂交体性能稳定，在杂交反应后可用RNA酶洗脱，以除去未结合的探针，因此特异性更强。
(2)检测的目的不同：RNA原位杂交检测和分析的主要为内源性基因，包括细胞内固有基因、异常基因和变异基因。
以正确反映组织与细胞之间相互关系及功能和代谢状态、探索疾病发病机理、观察治疗的疗效和评估疾病的预后等。
其次为对外源性基因检测，以获得病毒和细菌类型等病原学诊断。
而DNA原位杂交主要为外源性基因检测。
(3)有较高的灵敏度：在检出细胞和组织内在低拷贝核苷酸时，R NA原位杂交能获得较好定位，而DNA原位杂交则难以信任。
原位杂交原理
原位杂交原理原位杂交是一种重要的分子生物学技术，它可以用来检测细胞或组织中特定的DNA序列的存在和位置。
原位杂交的原理是利用DNA的亲和性，使标记了特定DNA序列的探针与待检测的DNA序列结合，然后通过染色或放射自显影等方法来检测探针的位置和数量，从而实现对目标DNA序列的定位和分析。
首先，进行原位杂交实验需要准备探针。
探针是一段标记了荧光物质或放射性同位素的DNA或RNA序列，它能与待检测的DNA序列特异性结合。
一般来说，探针的选择要根据待检测的DNA序列的特点来确定，可以是全基因组DNA、特定基因的DNA序列或者RNA序列。
其次，待检测的细胞或组织样本需要进行前处理，包括固定、脱水、变性等步骤，以使细胞或组织中的DNA得以裸露并保持在固定的位置。
然后，将标记了探针的DNA序列加入到前处理好的样本中，通过温度控制和亲和作用，使探针与待检测的DNA序列结合。
这一步是原位杂交实验的关键，探针的选择、标记的方式、杂交条件的优化都会影响实验的结果。
最后，通过染色、显微镜观察或放射自显影等方法来检测探针的位置和数量。
染色方法可以使用荧光染料或酶标记进行标记，通过显微镜观察标记物的位置和强度来判断待检测的DNA序列的存在和数量；而放射自显影则是利用放射性同位素标记的探针在放射底片上自显影的特性来检测探针的位置和数量。
总的来说，原位杂交原理是基于DNA的亲和性和特异性结合的原理，通过标记的探针与待检测的DNA序列结合，再通过染色或放射自显影等方法来检测探针的位置和数量，从而实现对目标DNA序列的定位和分析。
这一技术在细胞生物学、遗传学、病理学等领域有着广泛的应用，为科学研究和临床诊断提供了重要的技术支持。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作原位杂交实验原理与方法一、目的本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。
了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。
二、原理原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry ；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。
原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。
当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。
探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。
目前，大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA 中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I 和32P。
同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。
非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。
探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。
cDNA 探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA 探针。
原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。
菌落原位杂交( Colony in situ hybridization ) 菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。
将NDA烘干固定于膜上与32P 标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。
组织原位杂交( Tissue in situ hybridization ) 组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。
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原位杂交
1 探针的设计与合成
1)根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列，用premier primer5.0设计引物p81和p82，
以卤虫cDNA为模板，PCR扩增得到346bp的产物，用Takara胶回收试剂盒回收纯化。
引物编号引物序列长度
p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp
p82 GCTCAAACAGTGA TGCCAGT 20 bp
2)目的片段克隆
a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。
加入成分及比例如下：
目的PCR片段 5 μl
pGM-T载体（约50ng/uL） 1 μl
10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl
T4 DNA Ligase（3U/uL） 1 μl
无菌去离子水 3 μl
总体积10 μl
b. 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。
置于PCR仪中16℃过夜连接，反应结束后将离心管置于冰上。
c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG（50mg/ml）、40 μl的X-gal （20mg/ml），使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于37℃培养箱1-3小时，使溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。
d. 将10 μl的连接产物加到100 μl DH5 感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴半小时，将离心管置于42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴上放置2-3分钟，其间不要摇动离心管。
向离心管加入500 μl 37℃预热的LB（不含抗生素）培养基，150rpm摇床37℃振荡培养45分钟。
目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
将菌液于4000g下离心10分钟，去掉上清，加入100 μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。
待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。
e. 挑取白色菌落直接进行PCR检测，筛选转化子。
f. 将转化子接种于LB液体培养基中培养24小时，吸取1mL菌液送至大连宝生物公司进行序列测序。
3)重组质粒的线性化
取6 μl以测序的重组质粒，选取NcoI内切酶37℃酶切4h。
酶切反应体系为20 μl：
质粒 6 μl
10xK Buffer 2 μl
NcoI酶 1 μl
0.1% BSA 2 μl
灭菌水9 μl
终体积20 μl
取酶切前后的质粒各4 μl，经1%琼脂糖电泳检测，确认酶切完全，将酶切产物用Takara胶回收试剂盒回收纯化，作为探针合成的模板。
4)探针合成
按罗氏DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)试剂盒使用指南，标记反义RNA探针。
使用的所有试剂和器皿均经去RNase处理，合成方法如下:先准备反应体系。
冰上向RNase-Free的微离心管中顺序加入下列试剂:
纯化的线形质粒 1 μg
Rnase-free dH2O up to 13 μl
10xNTP labeling mixture 2 μl
10xTranscription buffer 2 μl
Rnase inhibitor 1 μl
SP6 RNA Polymerase 2 μl
总体积20 μl
稍混匀，短暂离心将反应液集于管底，37℃ 2 h。
反应结束后再补加2 μl DNase I，37℃ 15 min，反应结束后加入0.2M EDTA 2 μl 终止反应。
取3-5 μl 反应产物1%琼脂糖凝胶电泳检测。
-20℃保存备用。
2. 石蜡切片的制备
◆本实验在杂交结束前均必须保证RNase-free.玻璃器皿采用180℃烘烤10小时。
其它采用DEPC处理，高温灭菌锅高温降解DEPC。
若仪器不能高温处理，可用3%的H2O2处理半小时以上，DEPC水冲洗干净，烘干。
1)组织的固定与包埋
选取不同发育时期（0h，5h，10h，15h，20h，40h，3d，5d，7d）的卤虫，经DEPC处理水冲洗表面盐分后，加入新鲜配制的4%多聚甲醛，于4℃固定5-8 h，再分别按下列顺序进行脱水、透明和包埋: 30%乙醇脱水1 h，50%乙醇脱水1 h，70%乙醇脱水1 h，80%乙醇脱水乙醇脱水1 h，90%乙醇脱水1 h，无水乙醇脱水1 h，无水乙醇脱水1 h，无水乙醇:二甲苯(1:l)透明10 min，二甲苯透明10 min、二甲苯:54℃石蜡(1:1)浸蜡30 min，54℃石蜡浸蜡1 h，54℃石蜡包埋。
2)组织切片：将包埋的组织按7 μm的厚度切片，在多聚赖氨酸处理的载玻片上滴加DEPC 处理水，组织片于42℃展片台上展片1小时，再置于40℃恒温箱中烘片12小时后放于4℃密封保存备用。
3. 杂交前处理
切片经二甲苯脱蜡2×15 min，无水乙醇:二甲苯(1:l) 5 min，100%-95%-80%-50%-30%乙醇脱水各5 min，后DEPC处理水2×5 min，然后进行杂交前切片处理，具体步骤如下:
1)lxPBS(pH7.4)室温孵育2x5 min。
2)0.3%TtitonX-100的PBS中去膜处理15 min。
3)lxPBS洗涤2x5 min。
4)无RNase的蛋白酶K(20 g/mL)37℃消化30 min。
5)100mMGly/PBS中洗2x5 min。
6)lxPBS洗涤2x5 min。
7)4%多聚甲醛(4℃)固定5min。
8)lxPBS洗涤2x5 min。
9)含有0.25%(W/v)的乙酸酐的100mM的三乙醇胺缓冲液(pH8.0)去电荷处理15 min(现配
现用)。
10)lxPBS洗涤2x5 min。
4.预杂交和杂交
1)滴加预杂交液于载玻片上，然后置于湿盒中，50℃预杂交2小时。
2)弃去预杂交液，立即滴加杂交液，置于湿盒中52℃杂交过夜。
5.杂交后处理
杂交完，以后的步骤不必要特意防RNA酶。
1)弃去杂交液，载片浸入2xSSC中2x15 min。
2)载片浸入1xSSC中55℃水浴摇动2x15 min。
3)用含20 g/mL的RNaseA的NTE缓冲液37℃消化30分钟，以去除未结合的探针。
4)载片浸入0.5xSSC中55℃水浴摇动2x15 min。
5)载片浸入0.5xSSC中室温10 min。
6. 抗体反应
1)用washing buffer清洗组织片5 min。
2)滴加封闭液缓冲液室温下处理组织片30 min。
3)用抗体液覆盖封闭后的组织片，置于湿盒中孵育3h以上。
4)Washing buffer 洗2x15 min。
5)Detection buffer 中平衡2-5 min。
7. 显色：加入显色液于湿盒中黑暗静止显色16h
8. 封片与观察：
1)显色合适时，用TE buffer终止着色反应，再用蒸馏水清洗。
2)滴加封片剂封片，显微镜下观察和摄影。