ISHprotocol荧光原位杂交技术实验方案
荧光原位杂交实验步骤
荧光原位杂交实验步骤嘿，咱今儿个就来讲讲这荧光原位杂交实验步骤哈！这实验呢，就像是一场精心编排的舞蹈，每一个步骤都得踩准点儿。
先说说样本准备吧，这就好比是给舞蹈演员选好合适的服装和道具。
得把样本处理得妥妥当当的，不能有一点儿马虎。
要是样本没弄好，那后面的步骤可就都白搭啦！你说这重要不？接下来是探针标记，这就像是给舞蹈演员化上独特的妆容，让他们在舞台上更加耀眼。
得把探针标记得精准无误，这样才能在后续的过程中准确找到目标呀。
然后就是杂交啦！这就好像是舞蹈演员们在舞台上开始尽情舞动。
要让探针和样本完美结合，就像舞者之间的默契配合一样。
这可不是随随便便就能做到的哟！杂交之后还得进行洗涤，这就好比是舞蹈结束后给演员们清理一下身上的汗水和灰尘。
把那些多余的、不需要的东西都洗掉，只留下最精华的部分。
再之后就是检测啦！这就像是观众们在欣赏舞蹈表演，要能清楚地看到演员们的精彩表现。
通过检测，我们才能知道实验的结果到底怎么样。
最后是分析数据，这就像是对舞蹈表演进行评价和总结。
看看哪些地方做得好，哪些地方还需要改进。
这一步可不能小瞧，它能让我们不断进步呢！你想想看，要是在实验过程中有一步没做好，那不就跟舞蹈中有人跳错了步子一样明显吗？所以啊，每一个步骤都得仔仔细细、认认真真地去做。
做这个实验就跟盖房子似的，每一块砖都得放稳了，房子才能坚固。
咱可不能图快就马马虎虎地做，那最后肯定得出问题呀！这荧光原位杂交实验可是个精细活儿，得有耐心、有细心，还得有那么点儿小技巧。
咱可不能小看了这些步骤，它们就像是一个个小环节，串起来才能完成这个大实验。
就像那句话说的，“千里之行，始于足下”，咱得一步一个脚印地把这实验做好。
总之呢，这荧光原位杂交实验步骤可都不简单，每一步都得用心去对待。
只有这样，咱才能在实验中取得好的结果，才能真正领略到科学的魅力呀！你说是不是这个理儿？。
原位杂交ISH方法
原位杂交技术(ISH)步骤与注意事项材料（一）仪器：光学显微镜、烤箱、温箱、水浴箱、电吹风机（二）器皿：塑料反应盒、玻片架、洗涤杯、微量移液器、Eppendorf 管（三）试剂：1．DEPC （所有的试剂以此配制，注：DEPC致癌，应在通风下进行，并避免接触皮肤；含有Tris 中不能用DEPC）3．0.2mol/L HCl 1.72ml 浓HCl，加ddH2O至1000ml4．20%冰醋酸20ml 冰醋酸,加ddH2O至100ml5．蛋白酶（50μg/ml）6．溶液I: 含0.1mol/L Tris、0.1mol/L NaCl、2mmol/L MgCl2、0.05% Triton X-100取12.1g Tris; 5.85g NaCl; 0.41g MgCl2·6H2O，溶于800ml ddH2O中，再加入0.5ml Triton X-100，用HCl调pH至7.5，加ddH2O至1000ml。
8×105Pa高压蒸汽灭菌15min7．溶液II: 含0.1 mol/L Tris、0.1mol/L NaCl、50mol/L MgCl2。
方法：取12.1gTris；5.85g NaCl ; 10.15g MgCl2·6H2O，溶于800ml ddH2O中，用HCl调至9.5 ddH2O至1000ml。
8×105Pa高压蒸汽灭菌15min。
8．4%多聚甲醛：A液：称4g多聚甲醛，加40ml ddH2O，加温至60℃后，边摇边滴加1mol/L NaOH至全部溶解。
B：液：1.69g NaH2PO4·2H2O，加30ml ddH2O至溶。
C液：0.39gNaOH 溶于20ml ddH2O中。
先将B液与C液混合后再加入A液，以1mol/L NaOH或HCl调pH 值至7.2~7.4，加ddH2O至100ml。
4℃保存。
9．去离子甲酰胺：新的。
10．20×SSC：含有3mol/L NaCl, 0.3mol/L SSC。
原位杂交ISH方法
原位杂交技术(ISH)步骤与注意事项材料（一）仪器：光学显微镜、烤箱、温箱、水浴箱、电吹风机（二）器皿：塑料反应盒、玻片架、洗涤杯、微量移液器、Eppendorf 管（三）试剂：1．DEPC （所有的试剂以此配制，注：DEPC致癌，应在通风下进行，并避免接触皮肤；含有Tris 中不能用DEPC）3．0.2mol/L HCl 1.72ml 浓HCl，加ddH2O至1000ml4．20%冰醋酸20ml 冰醋酸,加ddH2O至100ml5．蛋白酶（50μg/ml）6．溶液I: 含0.1mol/L Tris、0.1mol/L NaCl、2mmol/L MgCl2、0.05% Triton X-100取12.1g Tris; 5.85g NaCl; 0.41g MgCl2·6H2O，溶于800ml ddH2O中，再加入0.5ml Triton X-100，用HCl调pH至7.5，加ddH2O至1000ml。
8×105Pa高压蒸汽灭菌15min7．溶液II: 含0.1 mol/L Tris、0.1mol/L NaCl、50mol/L MgCl2。
方法：取12.1gTris；5.85g NaCl ; 10.15g MgCl2·6H2O，溶于800ml ddH2O中，用HCl调至9.5 ddH2O至1000ml。
8×105Pa高压蒸汽灭菌15min。
8．4%多聚甲醛：A液：称4g多聚甲醛，加40ml ddH2O，加温至60℃后，边摇边滴加1mol/L NaOH至全部溶解。
B：液：1.69g NaH2PO4·2H2O，加30ml ddH2O至溶。
C液：0.39gNaOH 溶于20ml ddH2O中。
先将B液与C液混合后再加入A液，以1mol/L NaOH或HCl调pH 值至7.2~7.4，加ddH2O至100ml。
4℃保存。
9．去离子甲酰胺：新的。
10．20×SSC：含有3mol/L NaCl, 0.3mol/L SSC。
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中的位置的技术。
下面将详细介绍荧光原位杂交的具体步骤和相应的详细说明。
1.细胞准备首先，需要准备细胞样本。
可以选择使用原代细胞，细胞悬液或切片等。
2.固定将细胞固定在载玻片或载玻片上面。
固定通常使用的试剂是乙酸乙酯和甲醇的混合物，通常比例为1:33.水合将载玻片中的组织或细胞水合处理。
这一步可以通过将载玻片浸泡在去离子水或缓冲液中进行。
4.处理将载玻片进行预处理，以使DNA或RNA序列更易于杂交。
常用的预处理方法有：-煮沸：将载玻片浸泡在2×SSC（1×SSC：0.15MNaCl,0.015MNa3C6H5O7·2H2O,pH7.0）中，然后置于热盖板上加热至100°C，持续约10-20分钟。
-碱性水解：将载玻片浸泡在10%NaOH中，进行碱性水解，然后在盐溶液中冲洗。
5.杂交探针准备荧光探针或荧光标记的引物。
探针的选择取决于要检测的DNA或RNA序列。
探针的设计通常基于目标序列的序列信息，并且通过化学修饰和荧光标记以增加其杂交效率和检测灵敏度。
6.杂交将探针加到载玻片上的样本上，并与目标序列进行杂交。
杂交过程中，探针与目标序列进行互补配对，形成探针-目标复合物。
杂交的温度取决于探针的碱基组成和目标序列的GC含量。
7.洗涤将载玻片在洗涤缓冲液中进行洗涤，以去除未与目标序列杂交的探针。
8.检测使用荧光显微镜观察载玻片上的标记。
荧光标记的探针将通过荧光显微镜检测获得荧光信号。
根据荧光信号的数量和强度，可以确定目标序列的位置和数量。
9.成像和分析通过拍摄荧光显微镜图像来记录荧光信号。
使用图像处理软件进行图像分析，包括亮度分析和定量信号分析。
总结：荧光原位杂交是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中位置的强大技术。
荧光原位杂交(FISH)实验步骤
仪器设备1、医用微波炉；2、水浴锅；3、OL YMPUS BX51荧光显微镜；4、OL YMPUS DP11数字显微照相机。
FISH试剂（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；（2）20×SSC（pH7.0）；（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。
（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。
每次新鲜配制。
（6）杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。
每次新鲜配制。
调节pH前升至室温。
实验步骤1、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100％酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
2、蛋白酶处理:1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。
将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。
37℃孵育20min。
3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。
3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78℃孵育8min；4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。
4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
荧光原位杂交FISH实验步骤与方法(精选文档)
荧光原位杂交FISH实验步骤与方法（精选文档）（文档可以直接使用，也可根据实际需要修改使用，可编辑欢迎下载）FISH 实验步骤一、实验仪器：荧光显微镜:高速离心机：可达12000r/min高压灭菌锅：160C以上杀菌恒温箱：为杂交提供恒定温度恒温水浴锅照相机(与荧光显微镜配套)：荧光捕捉图片二、试剂的配制：1 、0.2mol/ L (pH7.4 磷酸缓冲溶液(PB试剂为NaH2P04 2H20 和Na2HP04 12H2O。
-----0. 2M 的NaH2P04溶液：31.2g NaH2P042H20,加蒸馏水1000mL溶解-----0. 2M 的Na2HP04溶液:71.632g Na2HP0412H2O 加蒸馏水至1000ml 溶解----0. 2M (pH7.4 磷酸缓冲溶液(PB : 19ml 的NaH2P04溶液和81ml 的Na2HP04溶液充分混合高压灭菌，常温保存。
2、0.03 mol/ L 磷酸盐缓冲溶液( (PBS)试剂为NaCl 和磷酸缓冲溶液PB——0.03MPBS溶液：22.8gNaCI , 150ml磷酸缓冲溶液(PB，加蒸馏水至1000ml，混匀——0.02 MPBS溶液：取100ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml——0.01 MPBS溶液：取50ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml高压灭菌，常温保存3、4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通风橱内进行操作）-----将略小于2/3体积的水（660ml）加热到50C,------40g多聚甲醛PFA，边搅拌边加入到水中，继续保持60C——1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小颗粒。
——1/3体积的PBS溶液，——用Hcl将pH调至7.2，定容，---- 用孔径为0.22卩谥勺滤膜过滤，—4 C保存最多保存两天，或者取少量保存在-20 C o（加热时温度不宜过高，为60C -65C，否则PFA容易降解，配置好后应尽快使用，否则固定效果较差）。
原位杂交技术（insituhybridization,ISH）
原位杂交技术（insituhybridization,ISH）我们常说，科学家也是艺术家，在明确真理探索科学的道路上，往往会创造出很多极具美感的艺术作品，比如下面的这些实验结果图，美吧~---Olson, B. D. and Downes, G. B.---in situ Hybridization of wild type Drosophila embryos所以今天小笔为大家介绍的就是能做出这种美美图的新技能，原位杂交实验~基本原理简单点说就是碱基互补配对原则。
官方来讲的话，就是我们将外源核酸（也就是常说的分子探针）与组织、细胞上待检测的DNA或RNA进行配对，形成核酸杂交分子，再经过一定手段将这个杂交分子的位置显示出来。
实验技术的更新是很快的，在明确了该技术的可行性后，科学家进一步改进并进行分类，主要有以下几类：荧光原位杂交技术：DNA分子原位杂交技术；在原技术手段上增加了荧光元素，技术手段较为先进，易掌握，运用广泛，一会儿小编会着重介绍哦~毕竟，能够在我们自己的实验中运用上，才是我们的最终目标嘛。
多彩色荧光原位杂交技术：显而易见，是荧光原位杂交的升级版，采用多个荧光来检测，目前的发展及运用也是较多的。
原位PCR：将原位杂交结合PCR技术发展起来的实验方法。
说实话，了解的比较少，我就不班门弄斧了，呵呵。
基因组原位杂交技术：该技术在我们的领域可能运用的毕竟少，主要是根据物种DNA同源性差异实现，在农作物等的杂交育种上运用较广，我就不详细介绍啦~明确了以上的分类及原理后，接下来小编主要讲讲在我们的领域中运用较广的荧光原位杂交方法。
结合示意图可以更好的理解哦~实验材料（重要的，基础材料不赘述）1. 4%多聚甲醛（1x PBS配置）：固定剂2. 蛋白激酶K：使得靶核酸暴露，增加探针和靶核酸结合。
3. 杂交缓冲溶液实验步骤取材：动物组织取材（小鼠采用心脏灌流法）后在4%的多聚甲醛中固定4小时左右， 1x PBS洗5次，每次30分钟，用25%蔗糖脱水过夜（均在4°进行）。
荧光原位杂交操作步骤
荧光原位杂交操作步骤荧光原位杂交听起来很复杂呢，其实操作步骤也有章可循啦。
一、样本准备。
要做这个实验，先得把样本处理好。
如果是细胞样本的话，就得把细胞乖乖地固定在载玻片上，就像把小娃娃放在小床上一样安稳。
这一步可不能马虎，固定不好后面就不好办啦。
要是组织样本呢，得把组织切成薄片，薄到像纸片一样精致才行。
然后同样把它固定好，这就为后面的杂交打下了好基础。
二、探针准备。
接下来就是探针啦。
探针就像是专门去找目标的小侦探。
得按照实验要求把探针配好，浓度要刚刚好哦，太浓了可能会乱了阵脚，太稀了又可能找不到目标。
把探针在合适的缓冲液里调配好，就像给小侦探准备好装备一样。
三、杂交反应。
然后就到了杂交这一步啦。
把准备好的探针滴到有样本的载玻片上，再盖上盖玻片。
这时候就像把小侦探放到了有目标的地方，让它们去寻找匹配的东西。
然后把载玻片放到一个合适温度的环境里，这个温度很关键呢，就像给小侦探们创造一个舒适的工作环境。
在这个环境里让探针和样本中的目标DNA或者RNA去结合，这个过程需要一点时间，就像小侦探寻找目标也不能太着急呀。
四、洗涤。
杂交完了之后呢，就要把那些没有结合的多余探针洗掉。
这就像是把那些凑热闹的家伙赶走，只留下真正找到目标的小侦探。
用合适的洗涤液轻轻地洗，可不能太粗暴，不然把已经结合好的也冲走了就糟糕啦。
五、检测。
最后就是检测啦。
这时候要用专门的荧光显微镜去看。
打开显微镜，就像打开一个神秘的宝藏盒子。
如果杂交成功了，就能看到漂亮的荧光信号啦，就像在黑暗中看到了闪闪发光的小星星。
那些荧光信号所在的地方就是探针找到目标的地方呢。
荧光原位杂交虽然有点复杂，但是按照这些步骤一步一步来，就像照顾小宠物一样细心，也能顺利完成这个有趣的实验啦。
荧光原位杂交试验方案
FISH鉴定反硝化聚磷菌试验方案1 试验材料与方法1.1 试验仪器高速离心机：可达36000转/分钟高压灭菌锅：160℃以上杀菌恒温箱：为杂交提供恒定温度荧光显微镜：捕捉荧光图片恒温水浴锅纯水机1.2 试验所用试剂及配置方法（1）0.2mol/L（pH 7.4）磷酸缓冲溶液（PB）试剂为NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O。
首先称取NaH2PO4·2H2O 31.2g，加重蒸水至1000mL溶解即为0.2mol/L的NaH2PO4溶液；称取Na2HPO4·12H2O 71.632g，加重蒸水至1000mL溶解即为0.2mol/L的Na2HPO4溶液。
取19mL的NaH2PO4溶液和81mL的Na2HPO4溶液充分混合即为0.2mol/L（pH 7.4）磷酸缓冲溶液。
常温保存。
（2）0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS）试剂为NaCl和PB。
称取NaCl 8.5g和0.2mol/L的PB 50mL，加入到1000mL的容量瓶中，最后加重蒸水至1000mL，充分摇匀即可。
常温保存。
0.02mol/L的PBS，只需使PB的量加倍，即取100mL的PB即可。
以此类推。
（3）4%多聚甲醛溶液称取40g多聚甲醛，置于三角瓶中，加入500mL的0.1mol/L的PB，加热至60℃左右，持续搅拌使粉末完全溶解，滴加少量1mol/L NaOH使溶液清亮，再用1mol/L的HCl将PH 调至7.4，最后补足0.1mol/L的PB至1000mL，充分混匀即可。
（4）0.5mol/L（pH7.4）Tris-HCl缓冲液主要试剂为Tris（三羟甲基氨基甲烷）。
先用400mL蒸馏水溶解60.57gTris，加入大约420mL的HCl后，用1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH将pH调至7.4，最后加重蒸水至1000mL。
4℃冰箱保存。
（5）铬矾明胶液在1000mL烧杯中用800mL水加热溶解4g明胶，待其完全溶解后，再加入0.5g铬矾（十二水·碳酸钾铬）。
荧光原位杂交(FISH)实验步骤
FISH（原位杂交）SOP流程------探针直接带荧光标记一、FISH实验步骤1、石蜡切片脱蜡至水：将挑选好的组织切片置于切片架上放入烘箱中65℃烤片2-3h（观察组织周围石蜡是否被熔化流至切片边缘），烤片完成后将组织切片放入脱蜡机中脱蜡。
脱蜡完成后取出切片，进行抗原修复。
2、抗原修复：脱蜡完成后取出切片，进行酶修复。
稍甩净切片上水分，水平放置在孵育盒，用组化笔在组织周围画圈（过程中组织不能干片，组化笔不能碰到组织，否则会损坏组织或使抗体无法孵育到组织；不可用力按压组化笔以免笔内液体流出覆盖组织），蛋白酶K（PK）37度孵育15-20min，修复完后用PBS冲洗，再将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、固定：甩去残留在片子上的PBS，滴加4%多聚甲醛，室温孵育5min。
用PBS冲洗。
再将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、预杂交：滴加Hyb buffer（预杂交液）55度避光预杂交2小时。
5、准备探针：将探针原液与Hyb buffer按比例稀释，混合均匀后85℃变性3min,37℃平衡2min。
6、杂交：预杂交结束后，吸去Hyb buffer，滴加平衡后的杂交工作液，切片平放于湿盒内，37-42°C（杂交温度依据探针TM值确定）孵育过夜（湿盒内加少量水防止杂交液蒸发）。
7、洗涤：用1XSSC冲洗，浸泡2min。
（洗涤时间不宜过长，可能会洗掉表达）。
8、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育20min。
9、封片：PBS冲掉DAPI，切片稍甩干后用WGA封片剂封片（封片时应避免组织上出现气泡）。
10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。
（蓝光紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）二、荧光结果判读DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光。
ISH protocol 荧光原位杂交技术 实验方案
地高辛标记寡核苷酸，荧光标记二抗，ISH，冰冻切片操作过程：1、多甲固定：应尽量在半个小时内完成。
（固定时间以24-36小时为宜，避免RNA降解或固定过度。
）2、切片:为获得高杂交信号，冰冻切片应切成10um-20um。
（选用16um）（切好的片子可以保存在-70度中）但是要注意，保存在-70度中的切片，拿出来以后，立即在4%的多甲中重新固定，避免在重新固定前切片恢复室温。
（重新固定10-15min）3、用0.1MPB洗切片3*5min4、切片放入100%乙醇5min，空气中干燥。
杂交液：（20ml）藏于-20度20*SSC 4ml硫酸葡聚糖 4g去离子甲酰胺 10ml将他们溶解后，加入以下物质：Poly A（10mg/ml） 0.5 mlSsDNA（10mg/ml） 0.5 mltRNA （10mg/ml） 0.5 mlDTT (1M) 2ml50*Denhardts 0.2ml上述溶液可以配置后长期贮藏与-20度中，用前预热到37度。
杂交溶液：将地高辛加入杂交液中，探针的浓度需要摸索（一般是100ng-1000ng/ml，一般是以200ng/ml为起点来摸索条件），所加的杂交液的体积看切片的大小来决定，对于2cm*2cm的组织，一般是加50ul，但是对于嗅球，可能30-40ul足够。
加好杂交液以后，用盖玻片盖上切片（注意中间不要留有任何的气泡），为防止杂交液从盖玻片中流走，注意使切片保持水平，并且注意切片不能干燥，（干燥的话杂交会有一个很高的背景）在湿盒中37度杂交18小时，这个杂交时间可以延长到40小时来提高杂交的信号，但是前提是不能让切片干燥。
杂交后处理;制备0.5*SSC和1*SSC（从20*来稀释）并且保证这两种SSC在使用的时候的温度是55度。
注意配置0.5*SSC和1*SSC中含有10mM的DTT（将1.2g的DTT加入到800ml的SSC中）杂交后，用小镊子将盖玻片轻轻移走，然后倒掉杂交液，将切片放入洗液中，在振摇水浴中按照下面的要求来洗片：快洗： 1*SSC（10mMDTT）室温2*15min：1*SSC（10mMDTT）55度2*15min 0.5*SSC(10mMDTT) 55度1*10min 0.5*SSC（10mMDTT）室温将切片一直放在最后一步的溶液中一直到下一步操作。
荧光原位杂交实验
实验四荧光原位杂交实验一、实验目的1.掌握核酸杂交的基本原理、过程和操作；2.熟练掌握荧光显微镜的使用方法；3.掌握Image J软件进行图像融合的方法；4.理解荧光原位杂交技术的应用。
二、实验原理核酸杂交是以碱基互补为基础、以双链核酸分子在特定条件下的变性和复性为手段，对核酸分子进行定性和定量检测。
两条互补的核苷酸单链在特定条件下退火形成异质双链；应用荧光标记的探针与待检测材料中的单链核酸进行特异性结合，形成可悲检测的杂交双链核酸。
在显微镜下观察并记录结果。
本实验所用探针是位点特异性标记探针GSP myc，是由SpectrumOrange （552/576）直接标记的荧光DNA探针，长度为200bp，能识别8号染色体的着丝粒部位的α卫星序列。
三、实验器材和试剂防脱载玻片（premiere公司），医用砂轮，20×20mm盖玻片，橡皮胶，平板加热器，杂交盒，恒温水浴锅，玻璃染色缸，香柏油，荧光显微镜拍照系统，MYC基因扩增检测试剂盒。
四、实验步骤1.样品处理1）取细胞培养悬液5ml（107 cell）,2000rpm离心5min，去上清；2）加入10ml的0.075M KCl，吹打混匀，静置3min；3）37℃水浴箱低渗30min；4）加固定液2ml，吹打混匀，室温预固定10min；5）2000rpm离心5min，去上清；6）沉淀加固定液5~10ml，吹打混匀，-20℃冰箱静置30min；7）2000rpm离心5min，去上清。
2.制片1）取一张干净的载玻片，用砂轮在背面划“一”标记，尽量在中间或靠下端标记；2）加50ul固定液重悬细胞，取4ul悬液滴加到载玻片上的标记位置，室温晾干；3）平板加热器上烤片，60℃30min，显微镜下观察细胞密度；4）PBS洗涤3min；5）1%多聚甲醛室温固定10min；6）PBS洗涤3min；7）70%、90%、100%梯度乙醇脱水2min；8）取出玻片，室温晾干。
miRNA原位杂交
（5）杂交信号的放大
① 加封闭液I、 avidin-FITC，37 ℃温育20min。 ② 42～50 ℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。 ③ 加封闭液II、antiavidin， 37 ℃ 温育20min。 ④ PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
21
ISH：miRNA，参考PMID: 30233621
03 案例分析
如何撰写------荧光原位杂交
总起句：说明研究的对象是组织还是细胞，以及如何收集
标本的制备及处理：取组织切片，进行上述脱蜡及水饱和处理； 杂交：将切片放在杂交炉上，加入200μL的预杂交液，65℃下预杂交1 h 探针处理：原位杂交滴加终浓度为500ng/mL的LINC01082和miR-17-3p探针杂交液200μL ； 洗脱：湿盒55℃孵育1.5 h，55℃水浴中振荡洗涤25 min； 染色：滴加2-3滴NBT/BCIP避光反应，显色1 h。 杂交信号放大：待染色的信号强度适中时，纯水终止反应； 复染、脱色：核固红染色200μl，复染约1-5 min，在流水下冲洗玻片10 min。按照50%、75%、100 醇的顺序脱水处理，每步5 min； 封片：中性树胶封片，观察取数据并检测
2、第二句开始描述具体方法如下：
标本的制备及处理：在24孔培养板中放入盖玻片，取细胞按6× 104/孔接种 ，使细胞融合率在80%左右；
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03 案例分析
如何撰写------原位杂交
细胞的固定：取出玻片，PBS清洗后加入1mL 4%多聚甲醛室温固定，经蛋白酶K (2μg/mL) ，甘氨酸，及乙酞化试剂处理 杂交：加入250 μL预杂交液，42℃孵育1 h； 探针处理：吸除预杂交液，加入250 μL含有探针 (300 ng/mL) 的杂交液，42 ℃杂交过夜； 洗脱及染色： PBST清洗3次后，加入用PBST稀释的DAPI (1：800) 染液染核，染色5 min； 封片：用抗荧光猝灭剂封片，荧光显微镜 (Olympus，Japen) 下选取5个不同视野进行观察 并拍照检测
双向荧光原位杂交手册(2_dimension-FISH_protocol)
组织（细胞）间期核2-dimension DNA FISH实验步骤Note：依照本protocol 进行该实验两大关键因素：一是样品玻片的制备，包括细胞核释放的多少，点片的细胞密度，玻片背景的干净与否，溶液的新鲜程度，蛋白酶消化的时间等；二是BAC探针的制备纯化，包括BAC的纯度，探针的质量，不同探针的比例，与样品孵育的时间等；另外，温度，湿度，光照也要严格按要求进行。
一、组织间期核制备过程1．组织放入平皿中，加含50ul双抗的PBS 5ml泡10min。
2．用PBS洗一下，剪碎。
3．加胶原酶5ul和培养液5ml放入37度过夜。
（该步骤只针对不易释放游离细胞的组织）——过夜消化则以上操作均需在超净台进行，以防污染（细胞：PBS洗两遍，消化细胞，收集，PBS洗一遍，细胞数太少则不洗）。
4. 将组织碎块（细胞）在15ml离心管中加0.075M KCL 10ml，37 ℃水浴锅内低渗30min。
5.取出加固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）2-3滴混匀，室温1000rpm离心10min弃上清。
6.加固定液10ml混匀后，室温静置30min，离心弃上清。
7.步骤6重复三次后加入固定液1.5ml，混匀后静置1~2min，将上层较为清亮的细胞悬液约1ml转于1.5 ml EP管内4℃存放。
（长期可置-20℃冻存）8.点片：将适当细胞密度的悬液0.2-1µl点于玻片上，用钻石笔在玻片背面划出范围，室温过夜。
二、荧光探针的标记（随机引物）1. 预变性( PCR仪)template DNA (ds DNA) 200ng2.5 x Kenelow buffer (invitrogen) 10µlddH2O---------------------------------------------------Σ12.5µl95℃10min2. 取出PCR管, 立即放冰上1~2 min3. 室温加缺T的dNTP (A/C/G : T= 0.5 : 0.25), 各管加4µl4. 快速各加8µl所要标记的荧光素(eg.Cy3-dUTP)，马上避光5. 再各加0.5µl Kenelow酶，混匀后轻微离心一下（甩一下即可），37℃避光过夜（16小时以上），此时PCR管内溶液的总体积为25µl。
荧光原位杂交实验方法及步骤
荧光原位杂交实验⽅法及步骤2.38.1 实验⽅法及步骤(1) 探针变性将探针在75℃恒温⽔浴中温育5min，⽴即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。
(2) 标本变性a.将制备好的染⾊体玻⽚标本于50℃培养箱中烤⽚2～3h。
(经Giemsa染⾊的标本需预先在固定液中退⾊后再烤⽚)。
b.取出玻⽚标本，将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。
c.⽴即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰⼄醇系列脱⽔，每次5min，然后空⽓⼲燥。
(3) 杂交将已变性或预退⽕的DNA探针10µL 滴于已变性并脱⽔的玻⽚标本上，盖上18×18盖玻⽚，⽤Parafilm封⽚，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜(约15～17h)。
由于杂交液较少，⽽且杂交温度较⾼，持续时间⼜长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进⾏。
(4) 洗脱此步骤有助于除去⾮特异性结合的探针，从⽽降低本底。
a.杂交次⽇，将标本从37℃温箱中取出，⽤⼑⽚轻轻将盖玻⽚揭掉。
b.将已杂交的玻⽚标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。
c.在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5min。
d.在室温下，将玻⽚标本于2×SSC中轻洗⼀下。
e.取出玻⽚，⾃然⼲燥。
f.取200µL复染溶液(PI/antifade或DAPI/antifade染液)滴加在玻⽚标本上，盖上盖玻⽚。
(5) 杂交信号的放⼤(适⽤于使⽤⽣物素标记的探针)a.在玻⽚的杂交部位加150µL封闭液I，⽤保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
b.去掉保鲜膜，再加150µL avidin-FITC于标本上，⽤保鲜膜覆盖，37℃继续温育40min。
c.取出标本，将其放⼊已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。
FISH-荧光原位杂交实验原位杂交 实验报告
FISH-荧光原位杂交实验原位杂交实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用..掌握原位杂交技术的操作方法;熟练掌握荧光显微镜的使用方法..2. 实验原理荧光原位杂交Fluorescence in situ hybridization FISH是一门新兴的分子细胞遗传学技术;是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术..目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域..FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针;按照碱基互补的原则;与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合;形成可被检测的杂交双链核酸..由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列;因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位..与传统的放射性标记原位杂交相比;荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点;因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注..杂交所用的探针大致可以分为三类：1染色体特异重复序列探针;例如a卫星、卫星III 类的探针;其杂交靶位常大于1Mb;不含散在重复序列;与靶位结合紧密;杂交信号强;易于检测；2全染色体或染色体区域特异性探针;其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成;可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3特异性位置探针;由一个或几个克隆序列组成..探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法..间接标记是采用生物系标记的dUTPbiotin-dUTP经过缺口平移法进行标记;杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测;同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理;将荧光信号进行放大;从而可以检测500bp的片段..而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合;或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入..直接标记法在检测时步骤简单;但由于不能进行信号放大;因此灵敏度不如间接标记的方法..3. 实验用具及材料Y染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200mL移液器、20mL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温20..4. 实验方法及步骤1探针及标本的变性1探针变性将探针在75℃怛温水浴中温育5min;立即置0℃;5～10min;使双链DNA探针变性..2标本变性①将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3h..经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片..②取出玻片标本;将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min..③立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水;每次5min;然后空气干燥..2杂交将已变性或预退火的DNA探针10mL滴于已变性并脱水的玻片标本上;盖上18×18盖玻片;用Parafilm封片;置于源潮湿暗盒中37℃要交过夜约15～17h..由于杂交液较少;而且杂交温度较高;持续时间又长;因此为了保持标本的湿润状态;此过程在湿盒中进行..3洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针;从而降低本底..1杂交次日;将标本从37℃温箱中取出;用刀片轻轻将盖玻片揭掉..2将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次;每次5min..3在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次;每次5min..4在室温下;将玻片标本2×SSC中轻洗一下..4杂交信号的放大1在玻片的杂交部位加150mL封闭液I;用保鲜膜覆盖;37℃温育20min..2去掉保鲜膜;再加150mL avidin-FITC于标本上;用保鲜膜覆盖;37℃继续温育40min..3取出标本;将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次;每次5min..4在玻片标本的杂交部位加150mL封闭液II;覆盖保鲜膜;37℃温育20min..5去掉保鲜膜;加150mL antiavidin于标本上;覆盖新的保鲜膜;37℃温育40min..6取出标本;将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中;洗涤3次;每次5min..7重复步骤1、2、3;再于2×SSC中室温清洗一下..8取出玻片;自然干燥..9取200mL PI/antifade染液滴加在玻片标本上;盖上盖玻片..5封片可采用不同类型的封片液..如果封片中不含有Mowiol可使封片液产生自封闭作用;为防止盖片与载片之间的溶液挥发;可使用指甲油将盖片周围封闭..封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久..6荧光显微镜观察FISH结果先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野;然后打开荧光激发光源;FITC的激发波长为490nm..细胞被PI染成红色;而经FITC标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光..由于本实验使用的是Y染色体上的特异序列;因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳性;即使在末分裂的细胞中;也可以观察到明显的杂交信号..照相记录实验结果图16-1..附录I FISH相关溶液的配制120×SSC：175.3g NaCl; 882.g柠檬酸钠;加水至1000mL用10mol/L NaOH调pH至7.0..2去离子甲酰胺DF：将10g混合床离子交换树脂加入100mL甲酰胺中..电磁搅拌30min;用Whatmanl号滤纸过滤..3体积分数70%甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺;5mL 20×SSC;10mL水..4体积分数50%甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺;20mL 20×SSC;80mL水..5体积分数50%硫酸葡聚糖DS：65℃水浴中融化;4℃或-20℃保存..6杂交液：8mL体积分数25%DS; 20mL 20×SSC混合..或40mL体积分数50%DS;20mL20×SSC;40mL ddH2O混合取上述混合液50mL;与5mL DF混合即成..其终浓度为体积分数10% DS 2×SSC;体积分数50% DF..7 PI/antifade溶液PI原液：先以双蒸水配置溶液;浓度为100mg/mL;取出1mL;加39mL双蒸水;使终浓度为2.5mg /mL..Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液;使其浓度为10mg/mL;用0.5mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0..取上述溶液1mL;加9mL甘油;混匀..PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1：9比例充分混匀;-20℃保存备用..8DAPI/antifade溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI储存液;按体积比1:300;以antifade溶液稀释成工作液..9封闭液I：体积分数5% BSA 3mL;20×SSC 1mL;dd H2O 1mL; Tween 20 5mL混合..10封闭液II：体积分数5% BSA 3mL;20×SSC 1mL;goat serum 250mL; dd H2O 750mL; Tween 20 5mL混合..11荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL;20×SSC 1mL;dd H2O 3mL; Tween 20 5mL 混合..12洗脱液：100mL 20×SSC;加水于500mL;加Tween20 500 mL..13TE缓冲液：pH8.0: 10mmol/L Tris; HCl; 1mmol/L EDTA；pH7.6: 10mmol/L Tris; HCl; 1mmol/L EDTA；pH7.4: 10mmol/L Tris; HCl; 1mmol/L EDTA..14溶液I：25mmol/L Tris HClpH 7.4; 10mmol/L EDTA..15溶液II：10% SDS;0.2M NaOH..16溶液III：Kac 14.7g; HAc 5.8mL; 加水至50mL..17LB培养基：胰化蛋白胨10g;酵母提取物5g; NaCl 10g; 加水至1000mL;用5mmol/L NaOH 调pH值至7.0..附录II DNA探针的制备质粒DNA克隆的提取、纯化和鉴定..1用接种环挑取一小块-70℃冻存的转化菌;接种于5mL LB培养基中;37℃剧烈震荡过夜..2将收集到的菌液3000r/min离心10min;弃掉上清液..3向菌体沉淀中加入溶液I300mL; 溶液II 350mL;混匀后将其置于冰浴中片刻;再加溶液III 350mL混匀;加酚和氯仿混合液体积比为1：1500mL 后充分混匀..412000r/min离心10min..5取上清液;向其加入600mL异丙醇;充分混匀后以12000r/min离心15～30min;弃掉上清液..6用1500mL体积分数70%乙醇洗涤沉淀2～3次;晾干..7用TE缓冲液溶解DNA沉淀..8加水至200mL;以Rnase A终浓度200mg /mL在50℃水浴中消化30min..9加入酚、氯仿和异丙醇三者体积比25：24：1溶液200mL混匀;12000r/min离心2min..10取上清液;再加入氯仿和异戊醇溶液体积比为24：1200mL混匀;12000r/min离心2min..11取上清液;以20mL 3M NaAc及500mL体积分数100%乙醇沉淀DNA..12可将上述溶液在-70℃放置30min至1h以充分沉淀DNA;然后用12000r/min离心15min..13将沉淀用1.5mL体积分数70%乙醇轻洗;自然晾干..14用TE缓冲液溶解DNA..15取1～2mL上述纯化的DNA溶液;于8.0g/L琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电泳鉴定DNA并检测浓度..16取1mg DNA;用相应限制性内切酶4～5单位;BSA100～200mg /mL;于37℃水浴中酶解2～4h..17电泳观察;根据酶切片段数量及大小;估计DNA克隆插入片段大小..附录III 探针的生物素标记探针的标记可采用PCR或缺口平移法来制备;但多数情况下采用缺口平移法来制备..该过程包括以DNase I在DNA双链上作用产生缺口并以此作为第二反应步骤的作用赳噗;即大肠杆菌聚合酶I自缺口处进行修补合成..在修补合成互补链时将生物素标记的d-NTP掺入;从而复制出带有生物素标记的探针..本实验采用缺口平移法;按GIBCO公司提供的方法以biotin-14-dATP标记探针..标记好的探针可以在-20℃下长期保存..总反映体积50mL; DNA 1mg;10×dNTP 5mL; 10×Enzyme Mix 5mL..其中10×dNTP为：500mmol/L Tris·HClpH 7.850mmol/L MgCl2100mmol/Lβ-硫基乙醇100mg /ml去除核酸酶的牛血清白蛋白0.2mmol/L dCTP; 0.2mmol/L dGTP; 0.2mmol/L dTTP0.1mmol/L dATP; 0.1mmol/L biotin-14-dATP10×酶混合为：0.5units/mL DNA聚合酶I0.075untis/mL Dnase I50mmol/L Tris·HClpH 7.55mmol/L醋酸镁1mmol/L β-硫基乙醇0.1mmol/L苯甲基磺酰氟体积分数50%甘油100mg /mL牛血清白蛋白将上述混合液于16℃作用1h..用8.0g/L琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电检测标记产物..以DNA片段长约300～500bp为宜..如片段较大;则应加适量Dnase I继续酶切;直至DNA片段长度适中后;加5mL终止缓冲液300mmol/L EDTA终止反应..用乙醇沉淀的方法将探针与非掺入的核苷酸分开..一、荧光原位杂交FISH是一种简单、敏感、而容易操作的方法;结果迅速;并能在同一标本上检测多个不同的基因;可应用于细胞培养、染色体分裂像、冰冻切片和石蜡切片..FISH技术是利用特异的DNA探针;标记了生物素;地高辛、或荧光素;对检测细胞进行DNA-DNA原位杂交;并用荧光法显示..FISH实验步骤试剂配制：1变性液70%甲酰胺+ 2×SSC;pH7.0：4 ml 20×SSC；8 ml 蒸馏水；28 ml 甲酰胺..每次新鲜配制..2杂交后洗涤液：20×SSC 4 ml；蒸馏水16 ml；甲酰胺20 ml..每次新鲜配制..调节pH前升至室温..1. 用硅化玻片;石蜡切片;60℃烤片过夜..二甲苯脱蜡至酒精;斜置切片;空气中干燥..2. 蛋白酶处理：1每个染色缸40 ml 蛋白酶K消化溶液;配制方法如下：2×SSC 40 ml 倒入Facal管;在水浴槽中预热..将消化酶液加入管内;摇动直到酶溶解..2 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液..37℃孵育20 min..3 2×SSC在室温下漂洗切片3次;每次1 min..4梯度酒精脱水-20℃预冷;空气中干燥..3. 变性：1每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液；278℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；378℃孵育8 min；4 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2 min;再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内;每缸2 min；5空气干燥..4. 杂交：1准备探针；2取一个较大的湿盒;交叉放置切片；3滴10 μl 探针在切片的组织上;加盖玻片；4盖上湿盒盖;37℃孵育12~16 h..杂交后水洗：5镊子小心去除盖玻片；643℃预热杂交后水洗溶液40 ml 水洗切片15 min；72×SSC37℃洗两次;每次10 min；8切片放人染色缸的1×PBS内待检测;勿使切片干燥..检测：9从1×PBS中取出切片;除去过多的水分;避免标本干燥..把切片放入湿盒内;同时处理4张切片..10每张切片使用30~60 μl 罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素;室温下孵育20 min；11去掉塑料盖膜;把切片放入含1×PBS的染色缸..1×PBS室温下洗3次;每次2 min..扩增：12从1×PBS中取出切片;斜置切片使液体排出；13每张切片滴30~60 μl 抗-卵白素抗体;加塑料盖膜;室温孵育20 min；14去掉塑料盖膜;把切片放入含1×PBS的染色缸..1×PBS室温下洗3次;每次2 min；15从1×PBS中取出切片;斜置切片使液体排出；16每张切片滴30~60 μl 抗-卵白素抗体;加塑料盖膜;室温孵育20 min；171×PBS室温下洗3次;每次2 min..5. 细胞核染色：1张切片加10~20 μl DAPI;覆盖盖玻片并在室温下孵育2~5 ml；2尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱..切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察..二、用引物介导的原位标记PRINS是PCR和荧光原位杂交FISH的结合; PRINS是由未标记的序列特异性寡核苷酸探针与固定在细胞内的靶DNA互补序列;在聚合酶的驱动下;带有标记的脱氧核苷酸FITC-dUTP或半抗原-dUTP和dATP、dCTP、dGTP的延伸;依赖标记;新合成的DNA就能直接的或间接的带有FITC;用荧光显微镜观察..PRINS实验步骤1. 常规脱蜡浸入0.01 mol/L PBS；2. 用0.2 mol/L 盐酸处理5min；3. 蛋白酶K25 μg/ml消化37℃15 min；4. 分别用80%;95%和100%酒精脱水;室温干片；5. 加PCR混合液25 μL10 mmol/L Tris-HCl;50 mmol/L KCl;1.5 mmol/L MgCl2;各加200 μmol/L dATP;dCTP;dGTP;1.5 mmol/L dig-11-dUTP 1.5 μl;引物250 ng;Taq DNA 聚合酶2 U;加盖片；6. 94℃变性5 min后置入65℃湿盒中5 min；7. 用0.1×SSC液;65℃洗5 min；8. 片于65℃10~20 s；用4×SSC-0.1%吐温20液42℃洗5 min;2次；9. 经Buffer 1液洗后滴加20%羊血清封闭30 min；10. 加地高辛抗体复合物1：500室温下2 h；11. BufferⅢ液洗5 min；12. 用BCIP-NBT显色1~2 h;在镜下控制;终止显色；13. 用中性红或核固红衬染;酒精脱水;二甲苯透明;树脂封片..。
荧光原位杂交FISH技术---经典全面
FITC/594 Avdin TSA-Biotin 放大系统
过氧化物酶（POD）/ 磷酸酶（AP）
连接臂
地高辛标记探针
探针制备流程
RNA抽提
反转cDNA
质粒合成
带有T7、SP6序列及 目的基因的质粒
扩增目的基因
设计带有T7/SP6/T3 序列的引物
线性化 体外转录 地高辛标记探针合成反应
荧光原位杂交技术新进展
M-FISH，armFISH(42-color M-FISH), SKY BAC-FISH, YAC-FISH Fiber-FISH PRINS ( Primed in situ DNA synthesis)引物原位DNA 合成
技术 IS-PCR (in situ polymerase chain reaction) 原位PCR GISH(Genome in situ Hybridization)基因组原位杂交 Immuno-FISH 3D-FISH Q-FISH（Quantitative-FISH），Flow-FISH T-FISH（Tissue-FISH）or (Telomere-FISH) RNA-FISH
基因组原位杂交（GISH）
RNA-FISH
T-FISH
蚕豆
红小豆
黄豆
豇豆
绿豆
水 稻
小 麦
玉 米
欢迎大家批评指正!!
荧光原位杂交技术
荧光原位杂交技术
一、技术原理 二、操作步骤 三、技术应用 四、技术进展
技术原理
原位杂交技术in situ hybridization(ISH)：通过 已知的碱基序列并带有标记物的探针与组织、细胞 中待测的mRNA进行特异性结合，形成杂交体，然 后再运用与标记物相应的检测系统，在核酸的原有 位置对其进行定位的方法。
荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤
荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。
其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量。
试验方法如下：1）玻片处理（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。
（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。
（c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。
（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37℃、2h，室温过夜)，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃过夜。
称量试剂勺也要干烤。
塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。
若为进口已处理的无RNase和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。
（e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1mL/L DEPC水配制。
2）样品制备及其所涉及的试剂包括：（a）缓冲溶液1×PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，溶入1000mL超纯水；3×PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，溶入1000mL超纯水；通常配制成10×PBS的储备液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。
ISHprotocol荧光原位杂交技术实验方案
地高辛标记寡核苷酸，荧光标记二抗，ISH，冰冻切片操作过程：1、多甲固定：应尽量在半个小时内完成。
（固定时间以24-36小时为宜，避免RNA降解或固定过度。
）2、切片:为获得高杂交信号，冰冻切片应切成10um-20um。
（选用16um）（切好的片子可以保存在-70度中）但是要注意，保存在-70度中的切片，拿出来以后，立即在4%的多甲中重新固定，避免在重新固定前切片恢复室温。
（重新固定10-15min）3、用0.1MPB洗切片3*5min4、切片放入100%乙醇5min，空气中干燥。
杂交液：（20ml）藏于-20度20*SSC 4ml硫酸葡聚糖 4g去离子甲酰胺 10ml将他们溶解后，加入以下物质：Poly A（10mg/ml） 0.5 mlSsDNA（10mg/ml） 0.5 mltRNA （10mg/ml） 0.5 mlDTT (1M) 2ml50*Denhar dts 0.2ml上述溶液可以配置后长期贮藏与-20度中，用前预热到37度。
杂交溶液：将地高辛加入杂交液中，探针的浓度需要摸索（一般是100ng-1000ng/ml，一般是以200ng/ml为起点来摸索条件），所加的杂交液的体积看切片的大小来决定，对于2cm*2cm的组织，一般是加50ul，但是对于嗅球，可能30-40ul足够。
加好杂交液以后，用盖玻片盖上切片（注意中间不要留有任何的气泡），为防止杂交液从盖玻片中流走，注意使切片保持水平，并且注意切片不能干燥，（干燥的话杂交会有一个很高的背景）在湿盒中37度杂交18小时，这个杂交时间可以延长到40小时来提高杂交的信号，但是前提是不能让切片干燥。
杂交后处理;制备0.5*SSC和1*SSC（从20*来稀释）并且保证这两种SSC在使用的时候的温度是55度。
荧光原位杂交实验具体步骤及方法
荧光原位杂交实验具体步骤及方法用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
1. 探针变性将探针在75℃恒温水浴中温育5 min，立即置0℃，5～10 min，使双链DNA探针变性。
2. 标本变性（1）将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3 h。
（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。
（2）取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70% 甲酰胺/2x SSC的变性液中变性2～3 min。
（3）立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5 min，然后空气干燥。
3. 杂交将已变性或预退火的DNA探针10 uL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18x18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17 h）。
由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。
4. 洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。
（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2xSSC中洗涤3次，每次5 min。
（3）在已预热42～50℃的1xSSC中洗涤3次，每次5 min。
（4）在室温下，将玻片标本于2xSSC中轻洗一下。
（5）取出玻片，自然干燥。
（6）取200 uL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
5. 杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）（1）在玻片的杂交部位加150 uL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
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地高辛标记寡核苷酸，荧光标记二抗，ISH，冰冻切片操作过程：1、多甲固定：应尽量在半个小时内完成。
（固定时间以24-36小时为宜，避免RNA降解或固定过度。
）2、切片:为获得高杂交信号，冰冻切片应切成10um-20um。
（选用16um）（切好的片子可以保存在-70度中）但是要注意，保存在-70度中的切片，拿出来以后，立即在4%的多甲中重新固定，避免在重新固定前切片恢复室温。
（重新固定10-15min）3、用0.1MPB洗切片3*5min4、切片放入100%乙醇5min，空气中干燥。
杂交液：（20ml）藏于-20度20*SSC 4ml硫酸葡聚糖 4g去离子甲酰胺 10ml将他们溶解后，加入以下物质：Poly A（10mg/ml） 0.5 mlSsDNA（10mg/ml） 0.5 mltRNA （10mg/ml） 0.5 mlDTT (1M) 2ml50*Denhardts 0.2ml上述溶液可以配置后长期贮藏与-20度中，用前预热到37度。
杂交溶液：将地高辛加入杂交液中，探针的浓度需要摸索（一般是100ng-1000ng/ml，一般是以200ng/ml为起点来摸索条件），所加的杂交液的体积看切片的大小来决定，对于2cm*2cm的组织，一般是加50ul，但是对于嗅球，可能30-40ul足够。
加好杂交液以后，用盖玻片盖上切片（注意中间不要留有任何的气泡），为防止杂交液从盖玻片中流走，注意使切片保持水平，并且注意切片不能干燥，（干燥的话杂交会有一个很高的背景）在湿盒中37度杂交18小时，这个杂交时间可以延长到40小时来提高杂交的信号，但是前提是不能让切片干燥。
杂交后处理;制备0.5*SSC和1*SSC（从20*来稀释）并且保证这两种SSC在使用的时候的温度是55度。
注意配置0.5*SSC和1*SSC中含有10mM的DTT（将1.2g的DTT加入到800ml的SSC中）杂交后，用小镊子将盖玻片轻轻移走，然后倒掉杂交液，将切片放入洗液中，在振摇水浴中按照下面的要求来洗片：快洗： 1*SSC（10mMDTT）室温2*15min：1*SSC（10mMDTT）55度2*15min 0.5*SSC(10mMDTT) 55度1*10min 0.5*SSC（10mMDTT）室温将切片一直放在最后一步的溶液中一直到下一步操作。
检测：将切片转移到TBS缓冲液中（100mM tris-HCl，150mM NaCl，PH=7.5），将切片在TBS缓冲液中洗3*5min，封闭：（可选）将切片放在封闭液中放置30min（封闭液配方:TBS+0.1%triton X-100+1%正常绵羊血清（sigma）或者是1%的其它合适的封闭剂（Roche））,将切片拿出封闭液中，用地高辛抗体和切片在TBS+0.1%triton X-100+1%正常绵羊血清（sigma）或者是1%的其它合适的封闭剂（Roche）于室温下孵育至少4小时，然后在TBS中洗3*5min ，然后在去离子水洗涤几次以去除盐，最后用抗淬灭剂分片观察原位杂交要做的对照;1、切片中mRNA的质量（前提是新鲜的组织样品）和protocol的有效性。
①PolyT探针：如果PolyT探针杂交的信号很弱的话，说明切片的RNA已经降解比较严重。
2、杂交特异性对照：①检测探针只是和RNA结合，用RNA酶处理后如果没有杂交信号的，则说明杂交只是和RNA结合。
（注意，RNA酶的处理应该在固定以后用PBS洗两次*5min立即进行）②用正义和反义探针来杂交，如果用正义探针杂交得不到任何的信号，则可以说明杂交的信号是特异性的杂交预处理：1、在37℃恒温箱内干燥切片后，滴加 5-10μg/ml蛋白酶K，置37℃湿盒内孵育30min， 4℃75％酒精漂洗5min中止蛋白酶K活性。
一般应用蛋白酶K 1μg/ml(于0.1 mol/L Tris,50 mmol/L EDTA,pH8.0缓冲液中)，37℃孵育15~20 min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。
蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。
甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂，常用0.1 mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗以终止蛋白酶K的消化作用，应用胃蛋白酶(Pepsin)20~100 μg/ml(用0.1 N HCl配)37℃、30 min进行消化，所获实验结果优于蛋白酶K。
为保持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定。
2、0.25% 醋酸酐10min, 经70℃ 2×SSC漂洗、40℃ 2×SSC各漂洗15min，2×SSC3min，切片经75-100% 酒精梯度脱水。
1. 蛋白酶K能消化和暴露被遮蔽的靶核酸，以增加探针的可结合性。
蛋白酶K 浓度过低，不能使靶核酸有效暴露，浓度过高则组织消化过度，也会影响检测结果。
蛋白酶K须用蛋白酶K缓冲液配制(0.1mol/L Tris-HCl PH 8.0，50mmol/L EDTA，经高压灭菌后备用)，蛋白酶K应新鲜配制，低温冰箱内分装保存。
蛋白酶K消化组织切片是原位杂交实验流程中重要环节，蛋白酶K浓度应力求准确无误。
2. 根据组织类型、固定液的种类，固定时间和切片的厚薄的不同，蛋白酶K浓度也存在差异，选用蛋白酶K最佳消化浓度是原位杂交成功的必要条件，不可省略预杂交预杂交液;临用前加；△预杂交液不加配制：先以去离子甲酰胺与SSC于室温混合，加入硫酸葡聚糖于50℃促溶，依次加入其它成份。
硫酸葡聚糖在室温常需数小时才能完全溶解。
有时需旋涡振荡。
定容后充分混合。
根据使用方便可分装（最好用铝箔将瓶子包好）存于4℃，可达数月。
注意，杂交缓冲液在使用前切忌污染1、将DEPC处理的切片经ddH2O漂洗 2×5min2、按组织片大小，每张切片滴加40μl杂交液，置37℃温盒内2小时杂交1、抖去甩干杂交溶液，用DAKO魔笔沿组织周围划圈，滴加30μl 探针杂交液/每张切片(内含20ng地高辛标记的探针)，在某温度下（改温度为：TM- ）湿盒内孵育过夜杂交液内加入变性剪切的鲑鱼精子DNA在杂交前加入，与其它杂交液分开储存。
杂交液能在－20℃保存几个月杂交后处理1、将切片置37℃ 2×SSC中漂洗2×10min。
2. 在37℃ 2×SSC 漂洗2×15min、1×SSC 漂洗2×15min、0.25×SSC 漂洗2×15min，均需用振荡漂洗切片。
最适复性温度（Optimunm renaturationtemperature, TOR）：Tor =Tm –25℃苛刻复性温度：Ts = Tm – (10 或15℃)非苛刻复性温度：Tns =Tm – (30 或35℃)在2×SSC 反应液中，可以根据下列公式计算最适复性温度：TOr =0.51 (G+C%)+47℃背景染色的形成是诸多因素构成的。
杂交后(Posthybridization)的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。
在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐(acetic anhydride)和三乙醇胺(t riethanolamine)中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。
在杂交后漂洗中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。
一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。
必须注意的是漂洗的过程中，切勿使切片干燥。
干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了4(1)2×SSC(2)2×SSC 55℃ 10 min×2(3)05×SSC 50℃ 5 min×2(4)缓冲液Ⅱ(含05%封阻试剂，用缓冲液Ⅰ溶解)37℃ 30 min(5)缓冲液Ⅰ(100 mmol/L Tris HCl,150 mmol/L NaCl pH75)15 min,(6)酶标地高辛抗体(1∶5 000，应用缓冲液Ⅰ解释)37℃ 30 min(7)缓冲液Ⅰ 15 min×2(8)缓冲液Ⅲ(100 mmol/L Tris HCl,100 mmol/L NaCl,50 mmol/L MgCl2,pH95)室温，2 min。
(2)其目的是去除未参与杂交体形成的过剩探针,消除与组织或细胞之间的非特异性结合的探针,降低背景染色,增加信/将杂交玻片从湿盒(或杂交仪)中取出,用2×SSC将盖玻片洗脱,2×SSC 30℃洗2次,每次15 min;1×SSC 42℃洗2次,每次15 min;05×SSC 37℃洗2次,每次15 min,TBS缓冲液洗2次。
注意在漂洗(5)①阳性对照:②阴性对照:用已知不含待测靶核酸序列的组织作对照。
⑤DNA酶消化靶DNA〖HJ1〗(6)非特异性染色可能会来自探针、组织内源性酶、组织细胞、显色系统等;探针特异性不高以及组织细胞内某些成分与显示系统中的抗体成分非特异结合也可造成非特异性染色。
组织细胞内源性酶是原位杂交中非特异性着色的重要原因,目前最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶,这两种酶都广泛存在于组织细胞中,因此用这些酶时应有消除内源性酶的相应步骤。
如过氧化物酶用3% H2O2处理5~10 min;10%冰醋酸处理组切片10 min,或在底物显色液中加入1 mmol/L左旋咪唑可防止内源性碱性磷酸酶的染色。
NBT/BCIP显示碱性磷酸酶时如果在光照下显色也会增强非特异性染色。
必须根据检测系统不同的标记酶作不同的内源酶处理。
2. 探针的长度原位杂交反应中探针浓度应超过靶序列的浓度，探针浓度必须给予该实验最大信噪比，因为背景着色度高低与探针浓度有关。
最佳探针浓度是最低探针浓度达到靶核酸的最大饱和结合度为目的。
探针浓度按其种类而略有不同，放射性标记cRNA探针的浓度为0.5ng/μl，而非放射性标记cRNA探针的浓度1.0ng/μl 。
杂交液的量要适当，每张切片以30-50μl为宜。
保持杂交液不流失的关键是，载玻片的清洁处理必须彻底，应用杂交罩等也很必要。
3.杂交的温度和时间设置和调整杂交温度是RNA原位杂交的重要环节。
杂交温度应低于解链或融解温度(melting temperature Tm)20-30℃。
多数RNA原位杂交Tm为95℃，由于这一温度对保存组织形态完整和组织切片的粘附将产生不利影响，为此在杂交液中常以增加甲酰胺浓度来降低Tm值，因为每增加1％甲酰胺浓度可降低0.72℃。
另外杂交体中GC的百分比，杂交体长度以及杂交液中Na+的浓度也与Tm呈正相关。
杂交反应的时间可随探针浓度的增加而缩短，杂交时间过短会造成杂交不完全，杂交时间过长会增加非特异性着色。