PCR常见问题分析

PCR常见问题分析

*假阳性

*出现非特异性扩增

现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者有时同时出现特异性扩增带

*如何进行长片段的扩增?

首先需选择正确的耐热聚合酶。Long Taq DNA Polymerase是具有3′-5′外切核酸酶活性的耐热DNA聚合酶，扩增效率高并且错配率低，对简单模板可扩增长达1 kb的片段，对复杂二级结构（GC rich等）和具有重复序列的模板可良好扩增长达15 kb的片段。此外，较长产物的扩增还需要相应调整引物设计、延伸时间、变性时间和缓冲液pH等。引物使用标准方法设计，通常18～24mers会得到较好的产量。按1kb/分钟的速率增加延伸时间使DNA聚合酶完成聚合反应。为了保证有效的长片段扩增，可以将延伸温度设置为68℃左右。同时为防止模板损伤，在每个循环将94℃变性时间减少到30秒或更短，扩增前升温至94℃的时间应低于1分钟。

*如何提高PCR扩增的保真性？

下游应用为基因筛选、测序、突变检测和分子诊断的用户，对PCR保真性要求很高。降低PCR扩增的错误率可以通过使用各种具有高保真性的DNA聚合酶来实现。DNA聚合酶的保真度用错误率来表示，包括碱基错配率、PCR产物突变百分数等。在目前已发现的所有耐高温DNA聚合酶中，Pfu酶的出错率最低，保真度最高（见附表）。除对酶进行选择，研究者也可通过优化反应条件来进一步减少PCR突变率，包括优化缓冲液组成、耐热聚合酶的浓度及对PCR循环条件进行优化等。

*应用/acl分析，通过对/acl目标基因进行扩增和克隆，检测PCR产物突变百分数，从而测定DNA 聚合酶的错误率。