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适用于限制性内切酶切割产生的平端 适用于粘端补齐或切平形成的平端
基因工程基本操作过程(ppt31页)
基因工程基本操作过程(ppt31页) 基因工程基本操作过程(ppt31页)
基因工程基本操作过程(ppt31页)
提高平头末端连接效率的方法包括：
①加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） ②加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞
基因工程要素：包括外源DNA，载体分子， 工具酶和受体细胞等
1.提取目的基因 2.目的基因与运载体结合
（基因表达载体的构建）是基因工程的核心。
3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测和表达
切、接、转、增、检
外源DNA片段同载体分子连接的方法， 即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于 限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用.
不会Βιβλιοθήκη Baidu身环化，转化率高，转化后的细菌克隆大 多数携带有目的基因的重组质粒。
基因工程基本操作过程(ppt31页)
基因工程基本操作过程(ppt31页)
一些内切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割产生DNA的 片段没有粘性末端，而是平末端。 具有平末端的 酶切载体只能与平末端的目的基因连接。 T4DNA 连接酶可催化相同或不相同的限制性内切酶切割 的平端间的连接。 平端连接比粘性末端连接要困 难的多，其连接效率很低，约有粘性末端连接的 1%。
机会； ③加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效
基因工程基本操作过程(ppt31页)
基因工程基本操作过程(ppt31页) 基因工程基本操作过程(ppt31页)
基因工程基本操作过程(ppt31页)
双酶切片段的定向克隆的优点
外源DNA只能以一个方向定向插入到重组质粒中， 以便目的基因的正确转录和表达。
载体与外源DNA结合处的限制酶切位点仍然保留， 可以随时从重组载体中通过相应的限制性内切酶 切割后分离获得目的基因。
基因重组: 就是利用 限制性内切酶及其他
一些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基 因．将两者连接起来，将目的基因插入于可 以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以 这种外源性的目的基因在受体细胞内得到扩 增或正确表达。
依不同的研究目的而定，认真设计最终构建的重组体 分子。需要考虑下列2个方面。 如果研究目的是：
(1) 表达有价值的蛋白质，要考虑选用适当的启动子、 增强子等调节序列和终止序列，要将目的基因置于启 动子的转录起始点的下游，并审视“阅读框”是否正 确，这些对表达融合蛋白至关重要。
(2) 对某一基因的上游序列进行调控机能分析，则需 考虑选择适当的报告基因，并将可能具有调控机能的 目的基因置于报告基因的上游适当位置。
上述方法的缺点：由限制酶产生的具有粘性末端的载 体DNA分子，在连接反应中常发生自我环化作用，并 在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合环状结构。
解决方法：用细菌的碱性磷酸酶预先处理线性的载体 DNA分子，去除其5‘末端的磷酸基。
基因工程基本操作过程(ppt31页)
基因工程基本操作过程(ppt31页) 基因工程基本操作过程(ppt31页)
① 3’凹端补平：使用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段部分 补平3’凹端，将不匹配的3‘凹端转换为粘端；或者完全补平， 产生平端DNA分子，可与任何其他平端DNA相连接。
② 3’突端切除：T4噬菌体DNA聚合酶具有强烈的3’- 5’外 切核酸酶活性，可将3’突端切除。
③ 平端加上人工合成接头：合成接头是自相互补的两个化学 合成的寡核苷酸的等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带一个 或多个限制性酶切位点的平端双链体。因此在平端DNA加接 头可为其亚克隆操作增加一个或多个限制性酶切位点。
载体DNA和目的基因DNA的连接,按DNA片 段末端性质不同，可有下述不同的连接方法：
① 粘性末端连接法 ② 平端连接法 ③ 同聚物加尾连接法 ④ 人工接头连接法
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1. 同一限制酶切位点连接:
由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完 全相同的末端。只要酶切割产生单链突出的粘性末端 和酶切位点附近的DNA序列不影响连接 .在连接酶的 作用下即可形成重组DNA分子.
目的基因与运载体结合
基因工程（genetic engineering）又称基因 拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传 学为理论基础，以分子生物学和微生物学的 现代方法为手段，将不同来源的基因按预先 设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子， 然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特 性、获得新品种、生产新产品。基因工程技 术为基因的结构和功能的研究提供了有力的 手段。
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2.不同限制酶切位点连接:
由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段、 具有相同类型的粘性末端，彼此称为互补末端也 可以采用粘性末端连接。
外源DNA和载体DNA经过两个限制性内切酶切割 后一侧产生的黏性末端，另一侧产生平未端（可 先生成黏性末端再补平）。
若调控基因可能有增强子作用，还应在报告基因下游 适当部位插入一个功能基因，由此反映增强子的作用。
为了将目的基因重组于载体分子之中， 需要将载体DNA和目的基因分别进行适 当处理，使其可以互相连接，形成新的 重组分子。
载体DNA通常有着许多酶切位点．但是并不是所 有的酶切位点都可用于重组切割，理想的酶切位 点应该符合下列几个条件:
1）位于载体上特定的酶切位点要尽可能少,最好是 单一酶切位点,这样才能保证目的基因和载体DNA 以最高的几率正确组合.
2） 在酶切位点之前要有一个较强的启动子，使 插入的目的基因可在该启动子的指导下高效表达。
3）选择的载体必须在连接后对基因转录和翻译过 程中的编码区读框不改变。
当载体和外源DNA用同样的限制性内切酶切割时，所形成的 DNA末端就能够彼此相匹配，可以被T4连接酶共价地连接起 来，形成重组体分子。 但是,当靶片段的末端与载体不匹配时， 必须转换其中一个或两个片段的末端形式以便使之连接。这种 末端的转换通常用以下三种方式转换：
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提高平头末端连接效率的方法包括：
①加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） ②加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞
基因工程要素：包括外源DNA，载体分子， 工具酶和受体细胞等
1.提取目的基因 2.目的基因与运载体结合
（基因表达载体的构建）是基因工程的核心。
3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测和表达
切、接、转、增、检
外源DNA片段同载体分子连接的方法， 即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于 限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用.
不会Βιβλιοθήκη Baidu身环化，转化率高，转化后的细菌克隆大 多数携带有目的基因的重组质粒。
基因工程基本操作过程(ppt31页)
基因工程基本操作过程(ppt31页)
一些内切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割产生DNA的 片段没有粘性末端，而是平末端。 具有平末端的 酶切载体只能与平末端的目的基因连接。 T4DNA 连接酶可催化相同或不相同的限制性内切酶切割 的平端间的连接。 平端连接比粘性末端连接要困 难的多，其连接效率很低，约有粘性末端连接的 1%。
机会； ③加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效
基因工程基本操作过程(ppt31页)
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基因工程基本操作过程(ppt31页)
双酶切片段的定向克隆的优点
外源DNA只能以一个方向定向插入到重组质粒中， 以便目的基因的正确转录和表达。
载体与外源DNA结合处的限制酶切位点仍然保留， 可以随时从重组载体中通过相应的限制性内切酶 切割后分离获得目的基因。
基因重组: 就是利用 限制性内切酶及其他
一些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基 因．将两者连接起来，将目的基因插入于可 以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以 这种外源性的目的基因在受体细胞内得到扩 增或正确表达。
依不同的研究目的而定，认真设计最终构建的重组体 分子。需要考虑下列2个方面。 如果研究目的是：
(1) 表达有价值的蛋白质，要考虑选用适当的启动子、 增强子等调节序列和终止序列，要将目的基因置于启 动子的转录起始点的下游，并审视“阅读框”是否正 确，这些对表达融合蛋白至关重要。
(2) 对某一基因的上游序列进行调控机能分析，则需 考虑选择适当的报告基因，并将可能具有调控机能的 目的基因置于报告基因的上游适当位置。
上述方法的缺点：由限制酶产生的具有粘性末端的载 体DNA分子，在连接反应中常发生自我环化作用，并 在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合环状结构。
解决方法：用细菌的碱性磷酸酶预先处理线性的载体 DNA分子，去除其5‘末端的磷酸基。
基因工程基本操作过程(ppt31页)
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① 3’凹端补平：使用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段部分 补平3’凹端，将不匹配的3‘凹端转换为粘端；或者完全补平， 产生平端DNA分子，可与任何其他平端DNA相连接。
② 3’突端切除：T4噬菌体DNA聚合酶具有强烈的3’- 5’外 切核酸酶活性，可将3’突端切除。
③ 平端加上人工合成接头：合成接头是自相互补的两个化学 合成的寡核苷酸的等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带一个 或多个限制性酶切位点的平端双链体。因此在平端DNA加接 头可为其亚克隆操作增加一个或多个限制性酶切位点。
载体DNA和目的基因DNA的连接,按DNA片 段末端性质不同，可有下述不同的连接方法：
① 粘性末端连接法 ② 平端连接法 ③ 同聚物加尾连接法 ④ 人工接头连接法
基因工程基本操作过程(ppt31页)
1. 同一限制酶切位点连接:
由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完 全相同的末端。只要酶切割产生单链突出的粘性末端 和酶切位点附近的DNA序列不影响连接 .在连接酶的 作用下即可形成重组DNA分子.
目的基因与运载体结合
基因工程（genetic engineering）又称基因 拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传 学为理论基础，以分子生物学和微生物学的 现代方法为手段，将不同来源的基因按预先 设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子， 然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特 性、获得新品种、生产新产品。基因工程技 术为基因的结构和功能的研究提供了有力的 手段。
基因工程基本操作过程(ppt31页)
2.不同限制酶切位点连接:
由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段、 具有相同类型的粘性末端，彼此称为互补末端也 可以采用粘性末端连接。
外源DNA和载体DNA经过两个限制性内切酶切割 后一侧产生的黏性末端，另一侧产生平未端（可 先生成黏性末端再补平）。
若调控基因可能有增强子作用，还应在报告基因下游 适当部位插入一个功能基因，由此反映增强子的作用。
为了将目的基因重组于载体分子之中， 需要将载体DNA和目的基因分别进行适 当处理，使其可以互相连接，形成新的 重组分子。
载体DNA通常有着许多酶切位点．但是并不是所 有的酶切位点都可用于重组切割，理想的酶切位 点应该符合下列几个条件:
1）位于载体上特定的酶切位点要尽可能少,最好是 单一酶切位点,这样才能保证目的基因和载体DNA 以最高的几率正确组合.
2） 在酶切位点之前要有一个较强的启动子，使 插入的目的基因可在该启动子的指导下高效表达。
3）选择的载体必须在连接后对基因转录和翻译过 程中的编码区读框不改变。
当载体和外源DNA用同样的限制性内切酶切割时，所形成的 DNA末端就能够彼此相匹配，可以被T4连接酶共价地连接起 来，形成重组体分子。 但是,当靶片段的末端与载体不匹配时， 必须转换其中一个或两个片段的末端形式以便使之连接。这种 末端的转换通常用以下三种方式转换：